Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

1. Preparando Chama-Sealed micropipeta de vidro Usando vidro microeletrodo, puxe uma micropipeta de patch-clamp padrão em um Flaming-Brown ou equivalente micropipeta extrator (diâmetro da ponta ~ 2 mm). Micropipeta lugar ponta na chama de um bico de Bunsen por aproximadamente 2 segundos até se formar uma bola fundida com um diâmetro de 200-300 mM. Lugar chama-selado pipeta de patch para titular em um micromanipulador, que pode ser rapidamente vibrou lado a lado (distância de viagem 100-200 mm) usando um bimorph piezoelétrico, relé, ou dispositivo equivalente eficaz. 2. Preparar fatias de cérebro de P1-P21 ratos ou camundongos Prepare líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) com a seguinte composição (em mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, e 10 D-glicose. Solução de bolha com 95% de oxigênio / 5% CO 2 gás para ~ 15 min, em seguida, adicione 2 mM CaCl 2 e 1 mM MgCl 2. Corte fatias de cérebro: Anestesiar animais com halotano ou isoflurano. Decapitar animais – remove cérebro – o cérebro bloco na orientação desejada (coronal, parassagital, transversal, etc) para incluir as regiões de interesse. Apor o cérebro bloqueou a fase de um cortador de cérebros vibrando submerso em ACSF – cérebro seção de 250-400 mM espessura – fatias lugar em ACSF aeradas com carbogênio em um "pré-incubação" câmara de compensação que permite fluido / exposição de gás em todas as superfícies – permitir fatias para equilibrar neste meio de pelo menos uma hora. 3. Vibrodissociation Preencher uma 35 milímetros de diâmetro, com placa de cultura HEPES-solução salina com a seguinte composição (mM): 150 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 D-glicose com pH ajustado para 7,4 com NaOH e osmolaridade ajustada a ~ 300 mOsm usando sacarose. Placas de cultura podem ser pratos suspensão, placas de cultura de padrão celular, placas de cultura com inserções lamela de vidro, pratos ou revestido com, por exemplo, poli-L-lisina, dependendo da necessidade de adesão de célula mais forte para o fundo do prato. Coloque a fatia na placa de cultura e visualizar com um estereoscópio dissecar a 250 x. Segure fatia para o fundo usando um fio de platina dobrada (0,5 mm de diâmetro) colocados sobre a superfície superior da fatia de agir como um peso. Posição da ponta da micropipeta chama-selada na superfície fatia na região do cérebro desejado. Micromanipulador ativar a vibrar a ponta lateralmente em 30/10 Hz, com a distância excursão ~ 100 mm. Usando o micromanipulador, mova a ponta mais profunda no tecido fatia de tal forma que ele passa a fatia inteira dentro de ~ 30 seg. Repita essa etapa conforme necessário para maximizar o número de neurônios isolados obtidos a partir de uma dada região do cérebro. Retire a ponta da fatia – pegar a fatia com uma pinça e agite-o suavemente, enquanto ainda em solução – em seguida, remova completamente fatia e descartar. Permitir que as células dissociadas de resolver e aderir ao fundo prato para pelo menos 10 min. 4. Gravação eletrofisiológicas Coloque o prato contendo neurônios no palco de um microscópio invertido e visualizar com 10 a 63 x x objetivo. Olhe para os neurônios com uma membrana de patente suave, não blebbing, e um núcleo detectável, mas não de grandes dimensões. Se óptica de contraste de fase são usados, procure fase brilhante com uma cor amarelada neurônios tinge, não muito azul. Superfuse células com solução extracelular contendo sais desejado, nutrientes, antagonistas do receptor, etc (o nosso padrão é o soro fisiológico HEPES-buffered mencionados acima (seção 3.1)), muitas vezes suplementado com 5 mM de 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] quinoxalina M-7-sulfonamida dissódico (NBQX), e 25-100 ácido D-2-amino-5-phosphonopentanoic (AP5) para bloquear os receptores ionotrópicos de glutamato que permite o isolamento de GABA rápido A iPSCs receptor mediada por 1,2. Puxe uma micropipeta de patch padrão usando um extrator Flaming-Brown ou equivalente. Pipeta resistência de ponta deve ser 2-4 mohms (dependendo do tamanho da célula de destino), quando preenchido com uma Cl – – ​​solução baseada. Estabelecer uma gravação de todo o celular de um neurônio visualizado usando técnicas eletrofisiológicas. Registro espontâneo correntes pós-sináptico (sPSCs) usando uma lacuna livre de protocolo de aquisição de dados. Aplicar 0,2-1 mM tetrodotoxina e / ou Ca 2 + baixo – contendo solução extracelular para gravar em miniatura correntes pós-sináptico (mPSCs). Soluções e agentes farmacológicos podem ser aplicados diretamente às células. Usamos superfusão locais de fundidos tubos quadrados com pontas de vidro com troca de solução que envolva o movimento lateral do tubo montado em um micromanipulador stepper-motor. Esta allofoi para a troca de solução em 10s a 100s de ms para conseguir mudanças rápidas no conteúdo molecular extracelular, a aplicação de agonistas do receptor, etc Akaike e colegas desenvolveram técnicas para estimular a única boutons pré-sináptica 3,4. A micropipeta é colocado perto de um bouton visualizados e estímulo é dado (correntes estímulo negativo de mA 10/05, 0,1-0,2 ms de duração). IPSCs unitária são registrados, e métodos como o método de falhas pode ser usado para examinar as alterações na função pré-sináptica e pós-sináptica. 5. Terminais de imagem pré-sináptica Neurônios pós-sinápticos pode ser preenchido com diversos corantes através da pipeta patch. Neurônios também pode ser feita a partir de camundongos que expressam proteínas fluorescentes (PQ), tais como a proteína verde fluorescente (GFP) em populações celulares. Terminais pré-sinápticos pode ser visualizado nos neurônios vibrodissociated feita a partir de camundongos que expressam PQ em populações interneurônio particular. Por exemplo, os camundongos expressando GFP impulsionada pela descarboxilase glutamato 65 (GAD65) somata promotor mostram verde e processos nas células do hipocampo e cesta interneurônios outros. Vibrodissociated neurônios piramidais da região CA1 do hipocampo têm terminais GFP positivas axônio apposed aos seus somata e dendritos proximal (Figura 1A). Neurônios piramidais vibrodissociated de camundongos que expressam synaptopHlourin (a pH-sensíveis mutante GFP fundida à vesícula sináptica associada VAMP2 proteína) sob controle do promotor Thy1 também têm boutons FP-positivos que mostram que fluorescence anexado pH-sensíveis (Figura 1B). Boutons pré-sináptico pode ser carregado com corantes de cálcio indicador e outras moléculas fluorescentes usando AM-esterificados compostos 5. A Figura 2 mostra um exemplo de carregamento com o corante indicador de cálcio-Fluo4-AM. Primeiro, M 1-2 AM-esterificados corante é aplicado aos neurônios a 37 ° por 10 min. Corante pode penetrar no meio intracelular, onde esterases decompor a molécula, produzindo corante, livre de células-impermeant e inextinguível. Esta abordagem carrega ambos os elementos pré e pós-sinápticos celular. Após o carregamento, as células são lavadas com HEPES-solução salina e mantidos a 37 ° para um adicional de 10 min. Antes de fazer uma GÊ selo com um eletrodo de pipeta de vidro, as células são lavadas 3 vezes com solução tampão externo. Uma gravação de célula inteira é então estabelecida usando uma solução de corante livre intracelular. Depois de 2-5 minutos de gravação, o corante é removido na maior parte do neurônio pós-sináptico, permitindo a visualização de Fluo-4-carregados boutons sináptica. Esta técnica foi iniciada por Ye et al 5. O boutons dye-carregado depois podem ser visualizadas usando uma ampliação alta, objetiva alta abertura numérica com um microscópio de uma câmera baseada ou multifotônica. Gravação de célula inteira e imagem simultânea de cálcio pode ser conseguido usando uma configuração como mostrado na Figura 3. As imagens do neurônio e boutons mostrado na Figura 2C foram capturados com um dispositivo acoplado multiplicando a carga do elétron (EMCCD) da câmera. O poder da fonte de luz para excitação foi atenuada para 1,2%, com um filtro de densidade neutra 1,0 e um filtro de íris ajustada para a saída de 12%. Transientes de cálcio do boutons verde pré-sináptico pode ser observado e gravadas em tempo real, e medidos offline. 6. Resultados representativos: Espontânea e atual Injection-Evocados disparo de neurônios Vibrodissociated Gravações de um típico vibrodissociated CA1 do hipocampo neurônio piramidal são mostrados na Figura 4A. Potenciais de ação espontâneos ultrapassagem pode ser observado em neurônios piramidais dissociada rato basolateral da amígdala, hipocampo e VTA 1,5. Durante a pinça de corrente-gravações de neurônios piramidais CA1, hiperpolarizantes injeção de corrente produz respostas tensão típica enquanto correntes despolarizantes de magnitude suficiente provocar potenciais de ação overshooting com o padrão de disparo típico atraso com moderada dos níveis actuais e potenciais não-acomodar ação em resposta a forte injeção de corrente ( Figura 4B). Espontânea e Miniature GABAérgica Inibitória Correntes pós-sinápticos em neurônios Vibrodissociated Durante a tensão de clamp gravações com uma solução de CsCl baseado intracelular, espontânea correntes sinápticas são observados (Figura 5A). Estes eventos são eliminados em solução contendo cálcio, baixa de 2,6, e na maioria dos tipos de neurônios são completamente bloqueada por antagonistas dos receptores GABA A, como bicuculina ou gabazine (Figura 5B, C), indicando que estes são sIPSCs mediada pela liberação de GABA e ativação deste subtipo de receptor ionotrópicos. No entanto, em neurônios principal de regiões do cérebro como a amígdala basolateral 2 ea área tegmental ventral 5,7, GABA Um bloqueio dos receptoresrevela EPSCs menor duração mediada pela ativação glutamatérgica da AMPA tipo de receptores. Curiosamente, a aplicação de TTX em concentrações que são específicos para o bloqueio da maioria da toxina sensível canais de sódio voltagem dependentes reduz a freqüência ea amplitude do sIPSCs observada em neurônios vibrodissociated de várias regiões do cérebro (Figura 6A) 2,4,7. Assim, a atividade dos canais de sódio participa na liberação de GABA na boutons beliscou-off sináptica. Ainda não está claro se full-blown potenciais de ação sódio ocorrem nesses terminais. É interessante notar que a resistência de entrada de um um terminal mM bem fechados axônio diâmetro é provável que seja assim para o intervalo GÊ. Assim, a abertura de até mesmo um pequeno número de canais de sódio pode ser suficiente para despolarizar terminais para ativar os canais de cálcio que medeiam a secreção de acoplamento excitação. Sobre o assunto destes canais de cálcio, as evidências sugerem que a N e P / Q-type canais de participação na liberação nos terminais GABAérgicos nos preparativos vibrodissociated CA1 do hipocampo de 8 e em outros lugares. Modulação e plasticidade de transmissão por uma série de neurotransmissores e receptores tem sido analisada através neurônios vibrodissociated 3,4,9. Os neurotransmissores demonstrado ter atividade moduladora tais adenosina, serotonina, GABA, os endocanabinóides, etc 2,6,10,11,12. Além disso, a curto prazo plasticidade sináptica, como endocanabinóide-dependente supressão induzida por despolarização de inibição (DSI) também tem sido descrito nesta preparação 2,11. Esses achados indicam que muitas formas de mediada pelo receptor e trans-sináptica sinalização por neuromoduladores endógenos estão intactas na preparação vibrodissociated. Transitórios de cálcio e liberação vesicular em Terminais Axon na preparação Vibrodissociated Usando o microscópio invertido equipado EMCCD descrever acima, temos examinado transientes de cálcio nos terminais pré-sinápticos na preparação neurônio bouton-vibrodissociated. A Figura 2 mostra o carregamento cela com AM-esterificados de diluição de corante Fluo-4 e posterior pós-sináptico em um neurônio CA1 do hipocampo piramidal. Transientes de cálcio espontânea são observados em alguns boutons dye-cheia mostrado como regiões de interesse (ROIs) na Figura 6B. Aplicação de 1 mM tetrodotoxina (TTX) elimina esses transientes espontânea, indicando que eles são mediados pela ativação de correntes de sódio voltagem dependentes que são ativados em boutons espontaneamente, levando ao aumento de cálcio subseqüentes. Aumentando KCl extracelular de 10 mm a 40 mm, com troca rápida solução produz um aumento de fluorescência medida em ROIs que correspondem a terminais pré-sinápticos (Figura 7A). Gravação simultânea do neurônio pós-sináptico é usado para monitorar sIPSCs e determinar se uma freqüência de eventos é aumentada pela alta-K + despolarização (Figura 7B). Para visualizar fusão das vesículas na boutons pré-sináptica, temos usaram camundongos expressando a synaptopHlourin construir sob o controle do promotor Thy1 (rotulado spH21 ratos). SynaptopHluorin em uma construção molecular em que pHlourin eclíptica (um mutante GFP com sensibilidade maior pH) 12 está ligada à proteína da membrana das vesículas associadas (VAMP2) 13. Este arranjo situa o motivo pHlourin no lúmen da vesícula onde o ambiente relativamente ácidas sacia fluorescência. Após a fusão das vesículas este motivo é exposto ao ambiente mais neutro extracelular com conseqüente aumento da fluorescência em puncta que correspondem às vesículas / terminais pré-sinápticos. Vibrodissociation de neurônios do hipocampo de ratos spH21 permite a visualização de puncta fluorescentes do tamanho e da localização esperada para os terminais GABAérgicos (Figura 8A). Aplicação do alto-K + – contendo solução externa aumenta fluorescência nestes terminais, e este efeito é bloqueado na presença de uma solução externa em que o cálcio extracelular é reduzida para 0,2 mM (Figura 8B). Assim, o aumento despolarização induzida por fluorescência de excitação parece refletir-secreção de acoplamento em sinapses GABAérgicos na preparação neurônio-bouton. A capacidade de medir transientes de cálcio pré-sináptico e fusão das vesículas nos terminais do axônio da preparação neurônio-bouton nos permite examinar os efeitos de neuromoduladores, drogas de abuso e plasticidade sináptica nos mecanismos envolvidos na excitação pré-sináptica da secreção de acoplamento e exocitose / endocitose. Essas técnicas também podem ser combinadas com outras ferramentas moleculares e ratos geneticamente modificadas para examinar os papéis de proteínas específicas em função pré-sináptica e modulação / plasticidade. Figura 1. Vibrodissociated neurônios da região CA1 do hipocampo (A) imagem mesclada de um DICnd imagens de fluorescência verde de um camundongo GAD65. Imagem DIC é fundido para mostrar claramente a localização dos terminais verde (B) a imagem de fluorescência de um camundongo synaptophluorin (spH21). Barra de escala = 10 mM Figura 2 O processo de cálcio indicador de carregamento: (A) de células inteiras é carregado com AM-esterificados corante; (B) de célula inteira de gravação dilui corante; (C) terminais são visualizadas como regiões de interesse (pontas de seta).. Figura 3. Diagrama esquemático da montagem experimental para a gravação de célula inteira e imagem simultânea de cálcio nos terminais pré-sinápticos nos neurônios vibrodissociated. EMCCD = Taxa de multiplicação de elétrons acoplado dispositivo. Figura 4. Representante mostrando formas de onda (A) os potenciais de ação espontânea de uma vibrodissociated CA1 neurônio e (B) as respostas de tensão de membrana para hiperpolarizantes despolarizantes e injeções de corrente em grampo corrente gravações de um neurônio CA1. Figura 5. (A) Representante formas de onda de iPSCs espontânea de um neurônio CA1 piramidal. (BC) A iPSCs foram bloqueados por qualquer gabazine (10 mM; B) ou bicuculina (20 mM; C). Figura 6. TTX inibe a transmissão sináptica gabaérgica espontânea e elimina transientes de cálcio pré-sináptico na preparação vibrodissociated hipocampo. (A) A gravação de um neurônio vibrodissociated antes e durante a aplicação TTX. Nota a diminuição da freqüência e amplitude de sIPSCs. (B) transientes de cálcio observado em um terminal Fluo-4-carregado em um neurônio pré-sináptico vibrodissociated antes e durante a aplicação TTX. Observe a perda completa de transientes. Figura 7. Indicador de imagem simultânea de cálcio e de gravação de célula inteira sIPSC mostrando efeitos de K + alta estimulação. (A) fluorescência medidos ao longo do tempo a partir de uma pré-sináptica bouton carregado com Fluo-dye 04:00. (B) o aumento simultâneo da freqüência e amplitude sIPSC durante a aplicação de alta + K. Figura 8. Ca 2 + dependentes de alto-K + resposta em boutons pré-sináptica dos neurônios piramidais spH21 da região CA1 do hipocampo. (A) imagem de fluorescência de um neurônio vibrodissociated. (B) High-K + aplicação (indicada pela barra preta) resultou em um aumento sustentado da fluorescência na presença do nosso extracelular Ca 2 + normais solução contendo (2 mM Ca2 +). Nenhum aumento de fluorescência foi observada em baixas Ca 2 + extracelular (0,2 mM Ca 2 +). Dados no gráfico foram normalizados para os níveis pré-high-K + de fluorescência, e mostrar médio de resposta de 3 boutons.