Vibrodissociation des neurones à partir de tranches de cerveau de rongeurs pour étudier la transmission synaptique et de l'image terminaisons présynaptiques

1. Préparation scellées à la flamme micropipette de verre L'utilisation de verre de microélectrodes, tirez une norme de patch-clamp sur une micropipette Flaming-Brown ou équivalent extracteur micropipette (pointe de diamètre ~ 2 um). Micropipette Placez la pointe dans la flamme d'un brûleur Bunsen pour ~ 2 sec jusqu'à obtention d'une boule de fusion avec un diamètre de 200-300 um. Placez scellées à la flamme pipette patch sur support sur un micromanipulateur qui peuvent être rapidement vibré côte à côte (distance à parcourir 100-200 pm) en utilisant un piézo bimorphe, relais, ou d'un dispositif de façon équivalente efficace. 2. Préparation des tranches de cerveau de P1-P21 rats ou des souris Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) avec la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 4,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, et 10 D-glucose. Solution à bulles avec de l'oxygène à 95% / 5% de CO 2 de gaz pour environ 15 min, puis ajoutez 2 mM de CaCl2 et MgCl2 1 mM. Couper des tranches de cerveau: Anesthetize animal avec l'halothane ou l'isoflurane. Décapitez animaux – enlever le cerveau – le cerveau de bloc dans l'orientation désirée (coronale, parasagittale, transversales, etc) afin d'inclure des régions d'intérêt. Apposez le cerveau bloqué à l'étape d'une trancheuse cerveau vibrant immergé dans aCSF – cerveau section à 250-400 um d'épaisseur – Placer les tranches de aCSF buller avec carbogène dans un "pré-incubation" chambre sur la compensation qui permet de fluide / exposition au gaz sur toutes les surfaces – permettent d'équilibrer les tranches dans ce milieu pendant au moins une heure. 3. Vibrodissociation Remplir un plat de 35 mm de diamètre culture avec HEPES solution saline tamponnée de composition suivante (mm): 150 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2, 10 D-glucose avec pH ajusté à 7,4 en utilisant NaOH et osmolarité ajusté à ~ 300 mOsm en utilisant le saccharose. Des boîtes de culture peuvent être plats de suspension, la norme boîtes de culture cellulaire, des boîtes de culture avec des inserts lamelle de verre, ou des plats revêtus de, par exemple, le poly-L-lysine, selon la nécessité de respecter forte cellulaire au fond plat. Placez la tranche dans la boîte de culture et de visualiser avec un stéréoscope disséquer à 250 x. Tenez tranche vers le bas en utilisant un fil de platine plié (0,5 mm de diamètre) placés sur la surface supérieure de la tranche d'agir comme un poids. Position de la pointe de la micropipette scellées à la flamme sur la surface de tranche dans la région du cerveau désirée. Activer micromanipulateur à vibrer l'extrémité latérale à 10-30 Hz, avec une distance d'excursion ~ 100 um. Utilisation du micromanipulateur, déplacer la pointe plus profondément dans le tissu tranche de telle sorte qu'il passe à travers la tranche entière dans ~ 30 sec. Répétez cette étape si nécessaire pour maximiser le nombre de neurones isolés obtenu à partir d'une région cérébrale donnée. Enlevez l'extrémité de la tranche – ramasser les tranches avec une pince et secouez-la délicatement tout en solution – puis retirez et jetez tranche complètement. Autoriser les cellules dissociées à s'établir et à adhérer au fond plat pour au moins 10 min. 4. Enregistrement électrophysiologique Placer le plat contenant des neurones sur la scène d'un microscope inversé et de visualiser avec 10 à 63 x objectif x. Regarde pour les neurones avec une membrane de brevets en douceur, sans bourgeonnement, et un noyau détectable mais pas surdimensionné. Si l'optique à contraste de phase sont utilisées, regardez pour la phase-lumineux neurones avec une teinte jaunâtre, pas trop bleu. Cellules avec une solution Superfuse extracellulaire contenant des sels désiré, les nutriments, les antagonistes des récepteurs, etc (notre standard est la solution saline tamponné HEPES mentionnés ci-dessus (article 3.1)), souvent complété avec 5 uM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tétrahydrobenzo [f] quinoxaline-7-sulfonamide uM disodique (NBQX), et de 25 à 100 D-2-amino-5-phosphonopentanoic acide (AP5) pour bloquer les récepteurs ionotropiques du glutamate qui permet d'isoler rapidement GABA Un CISP médiée par le récepteur 1,2. Tirez une micropipette de patch standard en utilisant un extracteur Flaming-Brown ou équivalent. Pipette résistance doit être 2-4 MQ (selon la taille de la cellule cible) lorsqu'ils sont remplis avec un Cl – – ​​solution basée. Etablir un enregistrement cellule entière à partir d'un neurone visualisés en utilisant des techniques standard de électrophysiologiques. Enregistrement spontanée courants postsynaptiques (sPSCs) en utilisant un écart sans protocole d'acquisition de données. Appliquer 0.2 à 1 uM tétrodotoxine et / ou faible teneur en Ca 2 + – contenant une solution extracellulaire pour enregistrer miniatures courants postsynaptiques (mPSCs). Solutions et agents pharmacologiques peuvent être directement appliqués aux cellules. Nous utilisons surfusion locale à partir des tubes en verre fusionné carré incliné avec l'échange solution impliquant le déplacement latéral de la tuyauterie montée sur un micromanipulateur stepper-moteur. Cette alloa été pour l'échange de solution dans de 10s à 100s de MS pour obtenir des changements rapides dans le contenu moléculaires extracellulaires, l'application d'agonistes des récepteurs, etc Akaike et ses collègues ont développé des techniques pour stimuler la seule boutons présynaptiques 3,4. Une micropipette est placé près d'un bouton de visualiser et de stimulation est donnée (courants stimulus négatif de 5-10 pA, 0,1-0,2 ms). CISP unitaires sont enregistrés, et des méthodes telles que la méthode d'échecs peuvent être utilisés pour examiner les changements dans la fonction présynaptique et postsynaptique. 5. Bornes d'imagerie présynaptiques Neurones postsynaptiques peuvent être remplies avec divers colorants via la pipette de patch. Les neurones peuvent également être fabriqués à partir de souris exprimant des protéines fluorescentes (PC) comme la protéine fluorescente verte (GFP) dans certaines populations cellulaires. Terminaux présynaptiques peuvent être visualisées sur des neurones de souris fait vibrodissociated qui expriment MF dans les populations interneurone particulier. Par exemple, des souris exprimant la GFP entraîné par le glutamate décarboxylase 65 (GAD65) soma montrent promoteur vertes et des processus dans les cellules de l'hippocampe et les interneurones panier d'autres. Vibrodissociated neurones pyramidaux de la région CA1 hippocampique ont terminaisons axonales GFP-positives à leurs apposed soma et des dendrites proximales (figure 1A). Neurones pyramidaux vibrodissociated de souris qui expriment synaptopHlourin (un pH-sensibles GFP mutante fusionnée à la vésicule synaptique associée VAMP2 protéines) sous contrôle du promoteur Thy1 ont également boutons FP-positives attachées qui montrent une fluorescence pH-sensibles (figure 1B). Boutons présynaptiques peut être chargé avec des colorants indicateurs de calcium et d'autres molécules fluorescentes utilisant AM-estérifiés composés 5. La figure 2 montre un exemple de chargement utilisant le colorant de calcium-indicateur Fluo4-AM. Tout d'abord, uM 1-2 AM-estérifiés colorant est appliqué à des neurones à 37 ° pendant 10 min. Dye peut pénétrer dans le milieu intracellulaire, où estérases cliver la molécule, ce qui donne, sans colorant cellulaire imperméants et inassouvi. Cette approche à la fois les charges d'éléments pré-et post-synaptiques cellulaires. Après le chargement, les cellules sont lavées avec HEPES solution saline tamponnée et conservés à 37 ° pendant encore 10 min. Avant de prendre une GQ-joint avec une électrode de pipette en verre, les cellules sont rincées 3 fois avec une solution tampon externe. Un enregistrement cellule entière est alors établie à l'aide d'une solution sans colorant intracellulaire. Après 2-5 min d'enregistrement, le colorant est surtout retiré du neurone post-synaptique, permettant la visualisation de Fluo-4-chargés boutons synaptiques. Cette technique a été lancée par Ye et al 5. Les boutons de teinture chargés peuvent ensuite être visualisées en utilisant un grossissement élevé, élevé l'objectif d'ouverture numérique soit avec un microscope à base de caméra ou multiphotonique. Simultanée de cellules entières d'enregistrement et d'imagerie calcique peut être réalisé en utilisant une configuration comme indiqué dans la figure 3. Les images du neurone et les boutons de la figure 2C ont été capturés avec un dispositif électronique de charge en multipliant couplé (EMCCD) caméra. La puissance de la source de lumière pour l'excitation a été atténué à 1,2% avec une densité de 1,0 neutres filtre et un filtre d'iris ajusté à la sortie de 12%. Transitoires de calcium de l'boutons verts présynaptique peut être observée et enregistrée en temps réel, et mesuré hors ligne. 6. Les résultats représentatifs: Spontanée et courant d'injection-évoqués des neurones Vibrodissociated Enregistrements à partir d'un neurone typique vibrodissociated hippocampique CA1 pyramidale sont présentés dans la figure 4A. Spontanée de potentiels d'action dépassement peut être observé dans les neurones pyramidaux dissociée de rat basolatérale amygdale, l'hippocampe et VTA 1,5. Lors de courant pince enregistrements de neurones CA1 pyramidale, hyperpolarisante injection de courant produit des réponses tension typique tandis que les courants de dépolarisation d'une ampleur suffisante susciter des potentiels d'action dépassement avec le motif de cuisson retardée typique avec des niveaux modérés actuels et potentiels d'action non-accommodante en réponse à l'injection de courant fort ( La figure 4B). Spontanée et miniatures GABAergique inhibitrice courants postsynaptiques des neurones Vibrodissociated Pendant voltage-clamp enregistrements avec une solution de CsCl à base intracellulaire, spontanée courants synaptiques sont observées (figure 5A). Ces événements sont éliminés en peu de calcium contenant une solution de 2,6, et dans la plupart des types de neurones sont complètement bloqués par les antagonistes des récepteurs GABA A, comme la bicuculline ou gabazine (figure 5B, C), indiquant que ce sont sIPSCs médiée par la libération du GABA et l'activation de ce sous-type de récepteur ionotropiques. Toutefois, dans les neurones principaux de régions du cerveau telles que l'amygdale basolatérale 2 et l'aire tegmentale ventrale 5,7, GABA A blocage des récepteursrévèle de plus courte durée EPSCs médiée par l'activation glutamatergique de type AMPA récepteurs. Fait intéressant, l'application de TTX à des concentrations qui sont spécifiques à des blocus de plus sensible à la toxine canaux sodiques voltage-dépendants réduit la fréquence et l'amplitude de la sIPSCs observées dans les neurones du vibrodissociated plusieurs régions cérébrales (figure 6A) 2,4,7. Ainsi, l'activité du canal sodique participe à la libération de GABA dans le pincé boutons-off synaptique. Il n'est pas encore clair si à part entière de potentiels d'action de sodium se produisent dans ces bornes. Il est à noter que la résistance d'entrée d'un puits scellé une terminaison axonale um de diamètre est susceptible d'être bien dans la gamme GQ. Ainsi, l'ouverture même d'un petit nombre de canaux de sodium pourrait être suffisant pour dépolariser terminaux pour activer les canaux calciques qui interviennent dans la sécrétion de couplage excitation. Sur le sujet de ces canaux calciques, les preuves suggèrent que N et P / Q-canaux de type participer à la libération des terminaux GABAergique dans les préparatifs du CA1 hippocampique vibrodissociated et ailleurs 8. La modulation et la plasticité de la transmission par un certain nombre de neurotransmetteurs et les récepteurs a été examinée en utilisant des neurones vibrodissociated 3,4,9. Les neurotransmetteurs démontré qu'ils ont des actions modulatrices telles sont l'adénosine, GABA, sérotonine, les endocannabinoïdes, etc 2,6,10,11,12. En outre, à court terme la plasticité synaptique, comme endocannabinoïde dépendante induit par la dépolarisation de suppression de l'inhibition (DSI) a également été décrite dans cette préparation 2,11. Ces résultats indiquent que de nombreuses formes de médiée par le récepteur et trans-synaptique de signalisation par les neuromodulateurs endogènes sont intactes dans la préparation vibrodissociated. Transitoires calciques et libération vésiculaire dans terminaisons axonales dans la préparation Vibrodissociated En utilisant le microscope inversé équipé EMCCD décrit ci-dessus, nous avons examiné les transitoires de calcium dans les terminaisons présynaptiques des neurones dans le vibrodissociated-Bouton de préparation. La figure 2 montre de chargement cellulaire avec radio AM-estérifiés de dilution Fluo-4 et suivants de teinture postsynaptiques dans un hippocampe CA1 neurone pyramidal. Transitoires calciques spontanées sont observées dans certains boutons remplies de teinture montré que les régions d'intérêt (ROI) dans la figure 6B. L'application de 1 uM de tétrodotoxine (TTX) élimine ces transitoires spontanées, ce qui indique qu'ils sont médiés par l'activation des courants sodiques voltage-dépendants qui sont spontanément activé dans boutons, conduisant à des hausses de calcium ultérieures. L'augmentation de KCl extracellulaire de 10 mm à 40 mm avec échange de solution rapide augmentation de fluorescence produit tel que mesuré dans ROIs qui correspondent à des terminaisons présynaptiques (figure 7A). L'enregistrement simultané du neurone post-synaptique est utilisé pour surveiller sIPSCs et de déterminer si la fréquence des événements est augmentée par la dépolarisation high-K + (figure 7B). Pour visualiser la fusion des vésicules dans les boutons présynaptiques nous avons utilisé des souris exprimant le synaptopHlourin construire sous le contrôle du promoteur Thy1 (étiqueté spH21 souris). SynaptopHluorin dans une construction moléculaire dans laquelle écliptique pHlourin (un mutant GFP avec sensibilité au pH améliorée) 12 est liée à la protéine de la membrane des vésicules associées (VAMP2) 13. Cet arrangement situe le motif pHlourin dans la lumière des vésicules où l'environnement relativement acide désaltère fluorescence. Après la fusion des vésicules de ce motif est exposé à l'environnement plus neutre extracellulaire avec une augmentation résultante de la fluorescence à lacrymaux qui correspondent aux vésicules / terminaisons présynaptiques. Vibrodissociation des neurones de l'hippocampe de souris permet spH21 pour la visualisation des points lacrymaux fluorescent de la taille et l'emplacement prévu pour les terminaux GABAergique (figure 8A). Application de la haute-K + – contenant une solution externe augmente la fluorescence dans ces bornes, et cet effet est bloquée en présence d'une solution externe dans lequel le calcium extracellulaire est réduite à 0,2 mM (figure 8B). Ainsi, l'augmentation induite par la dépolarisation de la fluorescence semble refléter l'excitation-sécrétion de couplage au niveau des synapses GABAergiques dans la préparation des neurones-Bouton. La capacité de mesurer transitoires calciques présynaptiques et la fusion des vésicules de terminaisons axonales des neurones de la préparation-Bouton nous permet d'examiner les effets de neuromodulateurs, l'abus des drogues et la plasticité synaptique sur les mécanismes impliqués dans l'excitation présynaptique-sécrétion d'accouplement et l'exocytose / endocytose. Ces techniques peuvent aussi être combinés avec d'autres outils moléculaires et génétiquement des souris pour étudier le rôle des protéines spécifiques dans la fonction présynaptique et la modulation / plasticité. Figure 1. Vibrodissociated neurones de la région CA1 hippocampique (A) image fusionnée de DIC uneND images de fluorescence verte d'une souris GAD65. L'image DIC est fusionné pour montrer clairement les emplacements des bornes verte (B) image de fluorescence à partir d'un synaptophluorin (spH21) de la souris. Barre d'échelle = 10 microns Figure 2 Calcium indicateur de chargement procédure: (A) à cellules entières est chargé avec AM-estérifiés colorant; (B) de cellules entières d'enregistrement dilue colorant; (C) terminaux sont visualisés comme des régions d'intérêt (flèches).. Figure 3. Schéma du montage expérimental pour une utilisation simultanée de cellules entières d'enregistrement et d'imagerie calcique dans les terminaux présynaptiques sur les neurones vibrodissociated. EMCCD = charge coupled device multipliant électrons. Figure 4. Représentant courbes montrant (A) des potentiels d'action spontanés à partir d'un neurone vibrodissociated CA1 et (B) des réponses de tension et de membrane pour hyperpolarisante dépolarisants injections de courant dans le courant de serrage des enregistrements à partir d'un neurone CA1. Figure 5 (A). Onde représentant du CISP spontanée d'un neurone CA1 pyramidale. (BC) Le CISP ont été bloqués par deux gabazine (10 uM; B) ou la bicuculline (20 uM; C). Figure 6. TTX inhibe la transmission GABAergique spontanée synaptique, et élimine les transitoires calciques présynaptiques dans la préparation vibrodissociated hippocampe. (A) Enregistrement à partir d'un neurone vibrodissociated avant et pendant l'application de TTX. Notez la diminution de la fréquence et l'amplitude des sIPSCs. (B) transitoires calciques observées dans un terminal Fluo-4-chargés sur un neurone présynaptique vibrodissociated avant et pendant l'application de TTX. Notez la perte complète des transitoires. Figure 7. Simultanée d'imagerie indicateur de calcium et sIPSC cellules entières d'enregistrement montrant les effets de K + grande stimulation. (A) Fluorescence mesurée au cours du temps à partir d'un bouton présynaptique chargé avec Fluo-quatre heures de teinture. (B) l'augmentation simultanée de la fréquence et l'amplitude au cours sIPSC haute K + application. Figure 8. Ca 2 +-dépendante de haute-K + réponse en boutons présynaptiques des neurones pyramidaux spH21 de la région CA1 hippocampique. (A) image de fluorescence d'un neurone vibrodissociated. (B) High-K + application (indiqué par une barre noire) a entraîné une augmentation soutenue de la fluorescence en présence de nos normale extracellulaire de Ca 2 + solution contenant (2 mM de Ca 2 +). Pas d'augmentation de fluorescence a été observée à faible extracellulaire de Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +). Les données ont été normalisées dans le graphique de pré-haute-K + niveaux de fluorescence, et de montrer de réponse moyen de 3 boutons.