Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

1. Vorbereitung Flame-Sealed Glasmikropipette Mit Mikroelektroden aus Glas, ziehen eine Standard-Patch-Clamp-Mikropipette auf einem Flaming-Brown oder gleichwertig Mikropipette Abzieher (Spitzendurchmesser ~ 2 um). Legen Sie Mikropipette in die Flamme eines Bunsen-Brenner für ~ 2 Sekunden, bis eine Kugel verschmolzen Formen mit einem Durchmesser von 200-300 mu m Spitze. Legen Flamme versiegelt Patchpipette in der Halterung auf einem Mikromanipulator, die schnell vibriert kann von Seite zu Seite (Wegstrecke 100-200 um) mit einem piezoelektrischen Bimorph, Relais, oder äquivalent effektives Gerät. 2. Vorbereitung Hirnschnitten von P1-P21 Ratten oder Mäuse Bereiten künstlichen Liquor (aCSF) mit folgender Zusammensetzung (in mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3 und 10 D-Glucose. Bubble-Lösung mit 95% Sauerstoff / 5% CO 2-Gas für ca. 15 min, dann fügen Sie 2 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2. Cutting Hirnschnitten: Anesthetize Tier mit Halothan oder Isofluran. Enthaupten Tier – entfernen Gehirn – blockieren Gehirn in der gewünschten Ausrichtung (koronal, parasagittal, quer, etc.), Regionen von Interesse sind. Befestigen Sie den gesperrten Gehirn auf die Bühne eines schwingenden Gehirn Allesschneider in aCSF untergetaucht – Abschnitt des Gehirns bei 250-400 mu m Dicke – statt Scheiben in aCSF sprudelte mit Carbogen in einem "Vorinkubation" Kammer zur Verrechnung, die für Flüssigkeit / Gas-Exposition auf allen Oberflächen ermöglicht – erlauben Scheiben in diesem Medium für mindestens eine Stunde ausgleichen. 3. Vibrodissociation Füllen Sie eine 35 mm Durchmesser Kulturschale mit HEPES-gepufferte Salzlösung der folgenden Zusammensetzung (mM): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 D-Glucose mit pH-Wert eingestellt auf 7,4 mit NaOH und Osmolarität auf ~ 300 mOsm mit Saccharose eingestellt. Kulturschalen können Aufhängung Gerichte, Standard Zellkulturschalen Kulturschalen mit Deckglas Einsätze, oder Gerichte mit, z. B. Poly-L-Lysin-beschichtete, in Abhängigkeit von der Notwendigkeit einer stärkeren Zelle Einhaltung der Schalenboden werden. Platzieren Sie die Scheibe in der Kulturschale und visualisieren mit einem Seziertisch Stereoskop bei 250 x. Halten Scheibe auf den Boden mit einem gebogenen Platindraht (0,5 mm Durchmesser) auf der Oberseite der Scheibe platziert, um so ein Gewicht zu handeln. Positionieren Sie die Spitze der Flamme versiegelt Mikropipette auf der Schnittfläche in die gewünschte Region des Gehirns. Aktivieren Mikromanipulator an die Spitze seitlich vibrieren bei 10-30 Hz, mit Exkursion Entfernung ~ 100 um. Mit dem Mikromanipulator, bewegen Sie die Spitze tiefer in die Scheibe Gewebe, so dass es durch das ganze Stück in ~ 30 sec geht. Wiederholen Sie diesen Schritt als notwendig, um die Anzahl der isolierten Neuronen, erhältlich aus einer bestimmten Region des Gehirns zu maximieren. Entfernen Sie die Spitze von der Scheibe – Abholung der Scheibe mit einer Pinzette und schütteln Sie sie vorsichtig, während noch in Lösung – dann entfernen Scheibe komplett und entsorgen. Lassen Sie die dissoziierten Zellen zu lösen und den Schalenboden haften für mindestens 10 min. 4. Elektrophysiologische Recording Die Schale mit Neuronen auf der Bühne eines inversen Mikroskops und visualisieren mit 10 x 63 x Ziel. Geben Sie für Neuronen mit einer glatten Patent Membran, keine Blasenbildung und einer nachweisbaren, aber nicht überdimensioniert Kern. Wenn Phasenkontrast-Optik verwendet werden, für die Phase-hellen Neuronen Look mit einem gelblich-Tönung, nicht zu blau. Superfuse Zellen mit extrazellulären Lösung mit gewünschten Salze, Nährstoffe, Rezeptor-Antagonisten, etc. (unser Standard der HEPES-gepufferte Salzlösung erwähnt wird (Abschnitt 3.1)), oft mit 5 uM 2,3-Dioxo-6-nitro-1 ergänzt, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] chinoxalin-7-Sulfonamid Dinatrium (NBQX) und 25-100 uM D-2-Amino-5-phosphonopentanoic Säure (AP5) zu ionotropen Glutamat-Rezeptoren, die für die Isolierung von schnellen GABA ermöglicht Block A-Rezeptor-vermittelten IPSCs 1,2. Ziehen Sie einen Standard-Patch-Mikropipette mit einem Flaming-Brown oder gleichwertig Abzieher. Pipettenspitze Widerstand sollte 2-4 MOhm (je nach Zielzelle Größe) werden, wenn mit einem Cl gefüllt – – basierte Lösung. Stellen Sie eine whole-cell recording von einem visualisiert Neuron mit Standard elektrophysiologische Techniken. Rekord spontane postsynaptische Ströme (sPSCs) mit einem lückenlosen Datenerfassung Protokoll. Bewerben 0,2-1 uM Tetrodotoxin und / oder niedrige Ca 2 + – haltigen extrazellulären Lösung Miniatur postsynaptischen Ströme (mPSCs) aufnehmen. Lösungen und pharmakologische Wirkstoffe können direkt auf Zellen angewendet werden. Wir verwenden lokale Superfusion aus geschmolzenem Quadrat-bestückte Glasröhrchen mit Lösung Austausch mit seitliche Bewegung des Rohres montiert auf einem Stepper-Motor angetrieben Mikromanipulator. Diese allowurde zur Herstellung Austausch in 10s bis 100s von ms auf den raschen Wandel in extrazellulären Inhalte, Anwendung der Rezeptor-Agonisten, etc. zu erreichen Akaike und seine Kollegen haben Techniken zur Stimulierung einzelner präsynaptischen boutons 3,4 entwickelt. Eine Mikropipette in der Nähe eines visualisiert bouton platziert und Anregung gegeben ist (negative Impulse Ströme von 5-10 uA, 0,1-0,2 ms Dauer). Unitary IPSCs aufgezeichnet werden, und Methoden wie die Methode der Ausfälle können verwendet werden, um Veränderungen in präsynaptische und postsynaptische Funktion zu untersuchen. 5. Imaging präsynaptischen Postsynaptischen Neuronen können mit verschiedenen Farbstoffen über den Patch-Pipette gefüllt werden. Neuronen können auch von Mäusen, die fluoreszierenden Proteinen (FPs) wie grün fluoreszierende Protein (GFP) in ausgewählten Zellpopulationen vorgenommen werden. Präsynaptischen visualisiert werden auf vibrodissociated Neuronen von Mäusen, dass FPs insbesondere Interneuron Bevölkerung zum Ausdruck gemacht. Zum Beispiel, Mäusen, die GFP durch die Glutamat-Decarboxylase 65 (GAD65)-Promotor zeigen grüne Somata und Prozesse im Hippocampus Korbzellen und andere Interneurone angetrieben. Vibrodissociated Pyramidenneuronen aus der hippocampalen CA1 Region haben GFP-positive Axonterminalen apposed ihre Somata und proximalen Dendriten (Abbildung 1A). Pyramidenneuronen vibrodissociated von Mäusen, die ausdrückliche synaptopHlourin (a pH-sensitive GFP-Mutante, fusioniert an die synaptischen Vesikel-assoziierten VAMP2 Protein) unter der Kontrolle der Thy1 Promoter haben auch FP-positive befestigt boutons, dass pH-sensitive Fluoreszenz (Abbildung 1B) zu zeigen. Präsynaptische boutons kann mit Kalzium-Indikator Farbstoffe und andere fluoreszierende Moleküle mit AM-veresterten Verbindungen 5 geladen werden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für das Laden mit dem Kalzium-Indikator-Farbstoff Fluo4-AM. Erstens, 1-2 um AM-veresterte Farbstoff zu Neuronen bei 37 ° C 10 min aufgetragen. Dye in die intrazelluläre Umgebung, wo spalten Esterasen das Molekül eindringen, wobei das freie, Zell-impermeante und ungelöschten Farbstoffs. Dieser Ansatz Lasten sowohl prä-und postsynaptischen zellulären Elementen. Nach dem Laden werden die Zellen mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und aufbewahrt bei 37 ° für weitere 10 min. Vor Abgabe eines GOhm-Dichtung mit einer Glaspipette Elektrode werden die Zellen 3 mal mit externen gepufferten Lösung gespült. A whole-cell recording wird dann eingerichtet mit einem Farbstoff-freie intrazelluläre Lösung. Nach 2-5 min von der Aufnahme wird der Farbstoff vor allem aus den postsynaptischen Neuron entfernt, so dass Visualisierung von Fluo-4-geladenen synaptischen boutons. Diese Technik wurde von Ye et al 5 Pionierarbeit. Der Farbstoff-beladenen boutons können dann visualisiert werden mit einer hohen Vergrößerung, hoher numerischer Apertur Ziel entweder mit einer Kamera-oder Multiphotonen-Mikroskop. Gleichzeitige whole-cell recording und Kalzium-Imaging kann mit Hilfe eines Setup wie in Abbildung 3 gezeigt. Die Bilder des Neurons und boutons in Abbildung 2C dargestellt wurden mit einem Elektronenmikroskop Multiplikation charge coupled device (EMCCD) Kamera eingefangen. Die Macht der Lichtquelle für die Anregung wurde abgeschwächt auf 1,2% mit einem neutralen Dichte 1,0-Filter und eine Iris-Filter angepasst, um 12% ausgegeben. Calcium-Transienten von der grünen präsynaptischen boutons beobachtet und aufgezeichnet werden in Echtzeit gemessen und offline. 6. Repräsentative Ergebnisse: Spontane und Current Injection-evozierte Firing von Vibrodissociated Neurons Aufnahmen von einem typischen vibrodissociated hippocampalen CA1 Pyramidenzellen Neuron sind in Abbildung 4A gezeigt. Spontane Überschießen Aktionspotentiale können in pyramidalen Neuronen losgelöst von Ratten basolateralen Amygdala, Hippocampus und VTA 1,5 beobachtet werden. Während Current-Clamp-Aufnahmen von CA1 pyramidalen Neuronen, hyperpolarisierenden Stromeinspeisung produziert typische Spannung Reaktionen während depolarisierende Ströme von ausreichender Größe zu entlocken Überschießen Aktionspotentiale mit den typischen verzögerten Zündung Muster mit mäßiger derzeitigen Niveau und Nicht-Aufnahme Aktionspotentiale in Reaktion auf stärkere Stromeinspeisung ( Abbildung 4B). Spontane und Miniature GABAergen inhibitorischen postsynaptischen Ströme in Vibrodissociated Neurons Während Voltage-Clamp-Aufnahmen mit einer CsCl-basierte intrazelluläre Lösung sind spontane synaptische Ströme beobachtet werden (Abbildung 5A). Diese Ereignisse sind in niedrigen Kalzium-haltigen Lösung 2,6 eliminiert und in den meisten neuronalen sind vollständig durch GABA A-Rezeptor-Antagonisten wie Bicucullin oder gabazine (Abbildung 5B, C), was darauf hinweist, dass diese sIPSCs von GABA-Freisetzung und Aktivierung vermittelt werden blockiert dieser ionotropen Rezeptor-Subtyp. Doch im Prinzip Neuronen aus Hirnregionen wie der Amygdala basolateralen 2 und dem ventralen Tegmentum 5,7, GABA A-Rezeptor-Blockadezeigt kürzere Dauer EPSCs durch glutamaterge Aktivierung von AMPA-Typ-Rezeptoren vermittelt. Interessanterweise reduziert Anwendung der TTX bei Konzentrationen, die spezifisch für Blockade der Toxin-sensitive spannungsabhängigen Natrium-Kanäle sind die Frequenz und Amplitude der sIPSCs in vibrodissociated Neuronen aus verschiedenen Hirnregionen (Abbildung 6A) 2,4,7 beobachtet. So beteiligt sich Natrium-Kanal-Aktivität in GABA-Freisetzung in die eingeklemmte off synaptischen boutons. Es ist noch nicht klar, ob ausgewachsene Natrium Aktionspotenziale in diesen Anschlüssen auftreten. Es ist erwähnenswert, dass der Eingangswiderstand gut verschlossen 1 uM Durchmesser Axonterminal wahrscheinlich bis weit in die GOhm Bereich liegen wird. So könnte Eröffnung sogar eine kleine Anzahl von Natrium-Kanäle ausreichen, um Terminals depolarisieren die Kalzium-Kanäle, die Erregung Sekret Kopplung vermitteln zu aktivieren. Zum Thema dieser Kalziumkanäle, deutet einiges darauf hin, dass N-und P / Q-Typ-Kanäle in Release an GABAergen Terminals in der vibrodissociated Zubereitungen aus hippocampalen CA1 und anderswo 8 teilnehmen. Modulation und Plastizität der Übertragung durch eine Reihe von Neurotransmittern und Rezeptoren untersucht wurde mit vibrodissociated Neuronen 3,4,9. Die Neurotransmitter gezeigt, wie modulatorische Aktionen haben Adenosin, GABA, Serotonin, Endocannabinoide, etc 2,6,10,11,12. Darüber hinaus hat kurzfristige synaptische Plastizität, wie Endocannabinoid-abhängige Depolarisation induzierte Unterdrückung der Hemmung (DSI) auch in dieser Zubereitung 2,11 beschrieben worden. Diese Ergebnisse zeigen, dass viele Formen der Rezeptor-vermittelten und trans-synaptische Signalisierung durch endogene Neuromodulatoren intakt in die vibrodissociated Vorbereitung sind. Calcium Transienten und Vesicular Veröffentlichung in Axon-Terminals in der Vibrodissociated Vorbereitung Mit dem EMCCD ausgestattete inverse Mikroskop oben beschrieben, haben wir Kalzium Transienten in präsynaptischen in der vibrodissociated Neuron-bouton Vorbereitung untersucht. Abbildung 2 zeigt Beladung der Zellen mit AM-veresterte Fluo-4 und anschließende postsynaptische Farbstoffverdünnungskurve in hippocampalen CA1 Pyramidenzellen Neurons. Spontane Kalzium Transienten sind in einigen Farbstoff gefüllten boutons als Regions of Interest (ROI) in 6B gezeigt, beobachtet. Anwendung von 1 uM Tetrodotoxin (TTX) beseitigt diese spontanen Übergänge, was darauf hinweist, dass sie durch die Aktivierung von spannungsgesteuerten Natriumkanäle Strömungen, die sich spontan in boutons aktiviert vermittelt werden, was zu weiteren Calcium steigt. Steigende extrazellulären KCl von 10 mm bis 40 mm mit schnellen Lösung Austausch produziert erhöhte Fluoreszenz in ROIs, die präsynaptischen (Abbildung 7A) entsprechen gemessen. Gleichzeitige Aufnahme aus dem postsynaptischen Neuron wird verwendet, um sIPSCs überwachen und festzustellen, ob bei Frequenz von High-K + Depolarisation (Abbildung 7B) erhöht wird. Zur Visualisierung Vesikelfusion in der präsynaptischen boutons wir Mäusen, die synaptopHlourin unter der Kontrolle des Thy1 Promotor (beschriftet spH21 Mäuse) Konstrukt verwendet haben. SynaptopHluorin in ein molekulares Konstrukt, in dem Ekliptik pHlourin (a GFP-Mutante mit verbesserter pH-Empfindlichkeit) 12 ist es, die Vesikel associated membrane protein (VAMP2) 13 verbunden. Diese Anordnung situiert pHlourin Motiv in die Vesikel Lumen, wo der relativ sauren Milieu die Fluoreszenz. Nach Vesikelfusion dieses Motiv ist es, die eher neutralen extrazellulären Umgebung mit einem daraus resultierenden Anstieg der Fluoreszenz bei puncta, die Vesikel / präsynaptischen entsprechen ausgesetzt. Vibrodissociation von Neuronen im Hippocampus von Mäusen spH21 ermöglicht Visualisierung von fluoreszierenden puncta der Größe und Lage für GABAerge Terminals (Abbildung 8A) erwartet. Die Anwendung der High-K + – mit externen Lösung erhöht Fluoreszenz in diesen Anschlüssen, und dieser Effekt ist in Gegenwart von einer externen Lösung, in der extrazellulären Calcium bis 0,2 mm (Abbildung 8B) reduziert wird blockiert. Somit scheint die Depolarisation induzierte Anstieg der Fluoreszenz zu Anregungs-Sekretion Kopplung an GABAergen Synapsen in der Neuron-bouton Vorbereitung widerspiegeln. Die Fähigkeit zur präsynaptischen Calcium-Transienten und Vesikelfusion in Axonterminalen der Neuron-bouton Vorbereitung Maßnahme ermöglicht es uns, Auswirkungen von Neuromodulatoren, Drogen und synaptische Plastizität auf präsynaptische Mechanismen in Anregungs-Sekretion Kupplung und Exozytose / Endozytose beteiligt zu untersuchen. Diese Techniken können auch mit anderen molekularen Werkzeugen und gentechnisch veränderten Mäusen kombiniert werden, um die Rollen von bestimmten Proteinen in präsynaptischen Funktion und Modulation / Plastizität zu untersuchen. Abbildung 1. Vibrodissociated Neuronen aus dem Hippocampus CA1-Region (A) zusammengefügte Bild der DIC einnd grüne Fluoreszenz Bilder von einem GAD65 Maus. DIC Bild verschmolzen zu zeigen deutlich die Standorte der grünen Klemmen (B) Fluoreszenz Bild aus einer synaptophluorin (spH21) Maus. Maßstab = 10 pm Abbildung 2 Calcium-Indikator-Ladevorgang: (A) ganze Zelle ist mit AM-veresterte Farbstoff beladen; (B) whole-cell recording verdünnt Farbstoff, (C)-Terminals werden visualisiert als Regions of Interest (Pfeilspitzen).. Abbildung 3. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die gleichzeitige whole-cell recording und Kalzium-Imaging in präsynaptischen auf vibrodissociated Neuronen. EMCCD = Elektron Multiplikation charge coupled device. Abbildung 4. Representative Wellenformen zeigt (A) spontane Aktionspotentiale von einem vibrodissociated CA1 Neuronen und (B)-Membran Spannung Antworten auf Hyperpolarisation und depolarisierende Strominjektionen in Current-Clamp-Aufnahmen von einer CA1 Neurons. Abbildung 5. (A) Repräsentative Signale der spontanen IPSCs aus CA1-Pyramidenzellen Neurons. Oder Bicucullin (20 uM; C); (BC) Die IPSCs wurden entweder gabazine (B 10 M) blockiert. Abbildung 6. TTX hemmt spontane GABAergen synaptischen Transmission und beseitigt präsynaptischen Calcium-Transienten im vibrodissociated Hippocampus Vorbereitung. (A) Aufnehmen von einem vibrodissociated Neuron vor und während der TTX-Anwendung. Beachten Sie die Abnahme der Frequenz und Amplitude der sIPSCs. (B) Calcium-Transienten in einem Fluo-4-geladen präsynaptischen Terminal auf einem vibrodissociated Neuron vor und während der TTX-Anwendung beobachtet. Beachten Sie den vollständigen Verlust von Transienten. Abbildung 7. Gleichzeitige Calcium-Indikator Bildgebung und sIPSC whole-cell recording zeigt Auswirkungen der hohen K + Stimulation. (A) Fluoreszenz im Laufe der Zeit aus einer präsynaptischen Bouton mit Fluo-04.00 Farbstoff beladen gemessen. (B) bei gleichzeitiger Erhöhung der sIPSC Frequenz und Amplitude bei hohen K +-Anwendung. Abbildung 8. Ca 2 +-abhängige High-K +-Antwort in präsynaptischen boutons von spH21 pyramidalen Neuronen aus dem Hippocampus CA1 Region. (A) Fluoreszenzbild einer vibrodissociated Neurons. (B) High-K +-Anwendung (durch schwarze Balken) führte zu einem anhaltenden Anstieg der Fluoreszenz in Gegenwart von unserer normalen extrazellulären Ca 2 +-haltigen Lösung (2 mM Ca2 +). Keine Fluoreszenz Anstieg war bei niedrigen extrazellulären Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +) zu beobachten. Daten in der Grafik wurden vor High-K +-Fluoreszenz wieder normalisiert, und zeigen durchschnittliche Antwortzeit von 3 boutons.