Vibrodissociation нейронов из кусочков мозга грызунов по изучению синаптической передачи изображения и пресинаптические терминалы

1. Подготовка стеклянные запаянные микропипетки Использование микроэлектрода стекло, вытащить стандартный патч-зажим микропипетки на Flaming-Браун или эквивалент микропипетки съемник (наконечник диаметром ~ 2 мкм). Место микропипетки наконечник в пламени горелки Бунзена в течение ~ 2 сек до плавленого формы шар с диаметром 200-300 мкм. Место запаянные пипетки патча на держателе микроманипулятора, которые могут быть быстро вибрировать из стороны в сторону (проезд расстоянии 100-200 мкм) с помощью пьезоэлектрического биморфного, реле, или, что эквивалентно эффективной устройства. 2. Подготовка фрагментов мозга от P1-P21 Крысы или Мыши Подготовка искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) в следующем составе (в мм): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, и 10 D-глюкозы. Bubble решение с 95% кислорода / 5% СО 2 в течение ~ 15 мин, затем добавить 2 мМ CaCl 2 и 1 мМ MgCl 2. Резка мозга ломтиками: Обезболить животное с галотан или изофлуран. Обезглавьте животного – удалить мозга – блок мозга в желаемой ориентации (короны, парасагиттальных, поперечные и т. д.), включив в регионах, представляющих интерес. Прикрепите заблокирован мозга этапе вибрирующий мозг слайсер погружен в aCSF – раздел мозга на 250-400 мкм, толщина – место ломтики в aCSF пузырилась с карбогена в "предварительной инкубации" камеры на сетку, которая позволяет жидкости / газа воздействия на любых поверхностях – позволяют ломтиками, чтобы уравновесить в этой среде, по крайней мере один час. 3. Vibrodissociation Заполнить 35 мм в диаметре культуры блюдо с HEPES-солевой буфер решение следующего состава (мМ): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 2 MgCl, CaCl 2,5 2, 10 D-глюкозы с рН установлен в 7,4 использованием NaOH и осмолярность доводят до ~ 300 мОсм использованием сахарозы. Культура блюда могут быть подвески посуды, стандартных блюд клеточной культуры, культуры блюда со вставками стекла покровного, или блюда покрыта, например, поли-L-лизин, в зависимости от необходимости укрепления ячейки соблюдение блюдо дно. Место среза в культуре блюдо и визуализации с рассекает стереоскоп при 250 х Держите ломтик на дно использованием изогнутых платиновой проволоки (0,5 мм в диаметре), расположенных на верхней поверхности среза выступать в качестве веса. Поместите кончик запаянные микропипетки на срез поверхности в нужном отделе мозга. Активировать микроманипулятора вибрировать кончиком латерально на 10-30 Гц, с экскурсией расстоянии ~ 100 мкм. Использование микроманипулятора, перемещать кончиком глубже в срез ткани такова, что она проходит через весь срез в течение ~ 30 сек. Повторите этот шаг, сколько необходимо для максимального числа изолированных нейронов получить из данной области мозга. Удалите наконечник от среза – забрать часть щипцами и осторожно встряхните его в то же время в растворе – удалите часть полностью и выбросьте. Разрешить диссоциированных клетки для проведения расчетов и придерживаться блюдо дно, по крайней мере 10 мин. 4. Электрофизиологические Запись Место блюдо с нейронами на этапе инвертированного микроскопа и визуализации с 10 х 63 х к цели. Ищите нейронов с гладкой мембраны патент, не blebbing, и обнаружить, но не негабаритных ядра. Если оптики фазового контраста используется, посмотрите по поэтапному яркие нейронов с желтовато-оттенком, не слишком синий. Переливать клетки с внеклеточной раствор, содержащий желаемый солей, питательных веществ, антагонисты рецепторов, и т.д. (наш стандарт HEPES-солевой буфер, упомянутые выше (раздел 3.1)), часто с добавлением 5 мкМ 2,3-диоксо-6-нитро-1, 2,3,4-тетрагидробензо [F] хиноксалин-7-сульфонамид динатрия (NBQX) и 25-100 мкМ D-2-амино-5-phosphonopentanoic кислоты (AP5), чтобы заблокировать ионотропных глутаматных рецепторов, что позволяет для изоляции быстро ГАМК рецептор-опосредованного IPSCs 1,2. Вытяните стандартных микропипетки патч используя Flaming-Браун или эквивалент съемника. Пипетки сопротивление должно быть 2-4 МОм (в зависимости от целевого размера ячейки) при заполнении Cl – – ​​на основе решения. Создание целой клетки записи с визуализированы с использованием стандартного нейрона электрофизиологических методов. Запись спонтанных постсинаптических токов (sPSCs), используя разрыв без сбора данных протокола. Применить 0,2-1 тетродотоксин мкМ и / или низкой Ca 2 + – содержащие внеклеточной решение для записи миниатюрные постсинаптические токи (mPSCs). Решения и фармакологические препараты могут быть непосредственно применены к клеткам. Мы используем местные superfusion из плавленого квадратных наконечником стеклянные трубки с раствором обмена с участием боковое движение трубы монтируются на шагового двигателя микроманипулятора. Это аллобыл для решения обмена в 10-ым к 100s из мс для достижения быстрых изменений во внеклеточной молекулярной содержание, применение агонистов рецепторов, и т.д. Акаике и его коллеги разработали методы, чтобы стимулировать одного пресинаптического boutons 3,4. Микропипетки находится возле визуализированы Bouton и стимулирования дается (отрицательные токи стимулом 5-10 мкА, 0,1-0,2 мс). Унитарное IPSCs регистрируются, и такие методы, как метод сбои могут быть использованы для изучения изменений в пресинаптических и постсинаптических функции. 5. Изображений пресинаптических окончаний Постсинаптические нейроны могут быть заполнены различными красителями с помощью патча пипетки. Нейроны могут также быть сделаны из мышей, экспрессирующих флуоресцентных белков (ФП), такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) в отдельных клеточных популяций. Пресинаптические терминалы могут быть визуализированы на vibrodissociated нейронов из мышей, которые выражают ФП, в частности, население интернейронов. Например, мышей, экспрессирующих GFP обусловлен глутамат декарбоксилазы 65 (GAD65) промоутер шоу зеленый somata и процессы в клетках гиппокампа корзины и других интернейронов. Vibrodissociated пирамидных нейронов гиппокампа от региона CA1 у GFP-положительных аксонов терминалов соединенный с их somata и проксимальных дендритов (рис. 1А). Пирамидных нейронов vibrodissociated от мышей, которые выражают synaptopHlourin (рН-чувствительных мутантов GFP, слитый с синаптических пузырьков связанных VAMP2 белка) под контролем промотора Thy1 также FP-положительных прилагается boutons, которые показывают, рН-чувствительных флуоресценции (рис. 1В). Пресинаптических boutons могут быть загружены с кальцием индикатор красителей и других флуоресцентных молекул с помощью АМ-соединения сложных эфиров 5. На рисунке 2 показан пример загрузки использованием кальций-индикатор красителя Fluo4-AM. Во-первых, 1-2 мкМ AM-этерифицированные краситель наносится на нейроны при 37 ° в течение 10 мин. Краска может проникать во внутриклеточное среде, где эстераз расщеплять молекулы, что дает свободный, клеточно-impermeant и незамороженных красителя. Такой подход нагрузки как до, так и постсинаптические клеточных элементов. После загрузки, клетки промывают HEPES-солевой буфер решения и хранятся при температуре 37 ° С в течение дополнительных 10 минут. До принятия ГОм-печать с электродом пипетка стекло, клетки промывают 3 раза с внешними буферный раствор. Цельноклеточная запись затем устанавливается с помощью красителя свободного внутриклеточного раствора. После 2-5 минут записи, краситель в основном удален из постсинаптического нейрона, что позволяет визуализировать Fluo-4-загружалась синаптических boutons. Этот метод был впервые Е. и др. 5. Красителя загружены boutons могут быть визуализированы использовании большого увеличения, высокие численные цели диафрагмы или с камеры основе или многофотонной микроскопии. Одновременное цельноклеточная записи и кальция изображений можно достичь с помощью установки, как показано на рисунке 3. Образы нейрона и boutons показано на рисунке 2C были захвачены с электронным устройством умножения с зарядовой связью (EMCCD) камеры. Мощность источника света для возбуждения ослабленного до 1,2% с 1,0 нейтральной плотности фильтра и фильтра диафрагмой доводят до 12% мощности. Кальций переходных от зеленого пресинаптических boutons можно наблюдать и записать в реальном времени, и измеряется в автономном режиме. 6. Представитель Результаты: Спонтанное и текущие Injection-Вызванные Обжиг Vibrodissociated Нейроны Записи из типичных vibrodissociated гиппокампа СА1 пирамидальный нейрон показаны на рисунке 4A. Спонтанные потенциалы действия превышения можно наблюдать в пирамидных нейронов отделена от крыс базолатеральной миндалине, гиппокампе и VTA 1,5. Во время ток-зажим записи с СА1 пирамидных нейронов, гиперполяризующих инжекции тока производит типичные ответы напряжения при деполяризующего тока достаточной величины, вызывает превышение потенциалов действия с задержкой типичный образец стрельбы с умеренным текущих уровней и не-размещения потенциалов действия в ответ на сильный ток инжекции ( Рис 4В). Спонтанное и миниатюрные постсинаптические ГАМК Ингибирующее токи в Vibrodissociated Нейроны Во время напряжения-зажим записей с CsCl основе внутриклеточного решения, спонтанные синаптические токи наблюдаются (рис. 5А). Эти события будут устранены в низкое содержание кальция в раствор, содержащий 2,6, и в большинстве нейронов типа полностью блокирован ГАМК рецепторов, таких как бикукуллином или gabazine (рис. 5б, в), указывая, что это sIPSCs опосредованы ГАМК выпуска и активации этого подтипа рецепторов ионотропных. Тем не менее, в принципе, нейроны мозга от таких регионах, как базолатеральной миндалины 2 и вентральной области покрышки 5,7, ГАМК рецепторы блокадапоказывает меньшую продолжительность EPSCs посредничестве глутаматергической активацией АМРА-типа рецепторов. Интересно, что применение ТТХ при концентрациях, которые являются специфическими для блокады наиболее чувствительных к токсин напряжения закрытого натриевые каналы снижает частоту и амплитуду sIPSCs наблюдается в vibrodissociated нейронов от нескольких областях мозга (рис. 6А) 2,4,7. Таким образом, активность натриевых каналов участвует в ГАМК-релиз, в ущипнул-офф синаптических boutons. Пока еще не ясно, если полномасштабный потенциалов натрия действия происходят в этих терминалах. Стоит отметить, что входное сопротивление хорошо запечатаны 1 мкМ окончание аксона диаметра, вероятно, будет хорошо в ГОм диапазона. Таким образом, открытие даже небольшого количества натриевых каналов может быть недостаточно для деполяризовать терминалы для активации кальциевых каналов, которые опосредуют связи возбуждения секреции. По поводу этих кальциевые каналы, данные свидетельствуют о том, что N и P / Q-образные каналы участвовать в выпуске на ГАМК-терминалов в vibrodissociated препаратов из гиппокампа СА1 и в других местах 8. Модуляции и пластичности передачи ряда нейромедиаторов и рецепторов был рассмотрен использованием vibrodissociated нейронов 3,4,9. Нейротрансмиттеров показано, что такие действия являются модуляторных аденозин, ГАМК, серотонин, эндоканнабиноиды и т.д. 2,6,10,11,12. Кроме того, краткосрочные синаптической пластичности, таких как эндоканнабиноидов-зависимой деполяризации вызванного подавлением торможения (DSI) также был описан в этой подготовке 2,11. Эти результаты показывают, что многие формы рецептор-опосредованного и транс-синаптических сигнализации эндогенными нейромодуляторов целы в vibrodissociated подготовки. Кальций Переходные и везикулярного выпуска в Axon терминалов в Vibrodissociated подготовка Использование EMCCD оборудованных инвертированного микроскопа описано выше, мы рассмотрели кальция переходных процессов в пресинаптические терминалы в vibrodissociated нейрон-Bouton подготовки. На рисунке 2 показана ячейка нагрузки с АМ-этерифицированные Fluo-4 и последующего разведения постсинаптических красителя в гиппокампа СА1 пирамидальных нейронов. Спонтанное переходных кальция наблюдаются в некоторых красителей заполненные boutons показано, как регионы, представляющие интерес (трансформирования) на рис 6В. Применение 1 мкМ тетродотоксин (TTX) устраняет эти спонтанные переходных процессов, указывая, что они опосредованы активацией напряжения натриевых токов, которые спонтанно активизируется в boutons, что приводит к последующим поднимается кальция. Увеличение внеклеточной KCl от 10 мм до 40 мм с быстрым решением производит обмен увеличился флуоресценции, измеряемой в трансформирования, которые соответствуют пресинаптических окончаний (рис. 7а). Одновременная запись из постсинаптического нейрона используется для мониторинга sIPSCs и определить, если событие частоты увеличивается на высоком K + деполяризации (рис. 7б). Для визуализации пузырьков синтеза в пресинаптических boutons мы использовали мышей, экспрессирующих synaptopHlourin построить под контролем Thy1 промотора (помечены spH21 мышей). SynaptopHluorin в молекулярной построить в котором эклиптики pHlourin (GFP мутанта с повышенной чувствительностью рН) 12 связан с пузырьком связанные мембранный белок (VAMP2) 13. Этот механизм помещает pHlourin мотив в просвете пузыря, где сравнительно кислая среда гасит флуоресценцию. После слияния пузырьков этот мотив подвергается более нейтральный внеклеточной среде с результирующее увеличение флуоресценции при puncta, которые соответствуют пузырьки / пресинаптических окончаний. Vibrodissociation нейронов гиппокампа от spH21 мышей позволяет визуализации флуоресцентных puncta от размера и расположения ожидается ГАМКергических терминалов (рис. 8А). Применение высоких K + – содержащие внешнее решение увеличивает флуоресценции в этих терминалов, и этот эффект блокируется в присутствии внешнего раствора, в котором внеклеточного кальция снижается до 0,2 мм (рис. 8Б). Таким образом, деполяризация вызванного увеличением флуоресценции-видимому, отражает возбуждения секреции связи на ГАМК-синапсы в нейрон-Bouton подготовки. Способности измерять пресинаптических переходных кальция и пузырьков синтеза в аксон терминалы нейрон-Bouton препарата позволяет нам изучить последствия нейромодуляторов, наркотиков и синаптической пластичности на пресинаптические механизмы, участвующие в возбуждения секреции связи и экзоцитоза / эндоцитоза. Эти методы могут быть объединены с другими молекулярными инструментами и генной инженерии мышей для изучения роли белков в частности пресинаптических функции и модуляции / пластичность. Рисунок 1. Vibrodissociated нейроны из гиппокампа области СА1 () Объединенные образ DICм зеленых флуоресцентных изображений из GAD65 мыши. DIC изображение сливается четко показать расположение зеленых терминалов (B) флуоресценции изображение из synaptophluorin (spH21) мыши. Шкала бар = 10 мкм Рисунок 2 Кальций индикатор загрузки процедура: (А) всю камеру загружается с АМ-этерифицированные красителя; (B) цельноклеточная записи разбавляет краситель; (C) терминалов визуализируются как области интереса (наконечники стрел).. Рисунок 3. Схема экспериментальной установки для одновременной цельноклеточная записи изображений и кальция в пресинаптические терминалы на vibrodissociated нейронов. EMCCD = электронного умножения Прибор с зарядовой связью. Рисунок 4. Представителю сигналы отображаются () спонтанные потенциалы действия от vibrodissociated CA1 нейронов и (Б) ответы мембранные напряжения гиперполяризующих и деполяризующего тока инъекций в текущем зажим записи из нейронов СА1. Рисунок 5. () Представитель сигналов спонтанного IPSCs от СА1 пирамидальных нейронов. (BC) IPSCs были заблокированы либо gabazine (10 мкМ, B) или бикукуллином (20 мкМ, C). Рисунок 6. ТТХ ингибирует спонтанное ГАМКергических синаптической передачи, а также исключает пресинаптических переходных кальция в vibrodissociated гиппокампа подготовки. (А) Запись с vibrodissociated нейрона до и во время нанесения ТТХ. Обратите внимание на уменьшение частоты и амплитуды sIPSCs. (B), кальция наблюдается в переходных Fluo-4-загружалась пресинаптических терминала на vibrodissociated нейрона до и во время нанесения ТТХ. Обратите внимание на полную потерю переходных процессов. Рисунок 7. Одновременная визуализация показатель кальция и sIPSC цельноклеточная записи показывающие влияние высоких K + стимуляции. (А) флуоресценции измеряли с течением времени из пресинаптических Bouton загружены Fluo-4 утра краску. (B) Одновременное увеличение sIPSC частоты и амплитуды во время высокого приложение K +. Рисунок 8. Ca 2 +-зависимые высокого K + ответ в пресинаптических boutons из spH21 пирамидальных нейронов гиппокампа от региона CA1. (А) Флуоресценция образ vibrodissociated нейрона. (B), High-K +-приложения (показано черными бар) в результате устойчивый рост флуоресценции в присутствии нашего нормального внеклеточного Са 2 +-содержащий раствор (2 мМ Са2 +). Нет флуоресценции увеличение наблюдалось при низких внеклеточного Са 2 + (0.2 мМ Са 2 +). Данные в графе были нормализованы предварительного высокого K + флуоресценции уровнях, и показать средний отклик от 3 ​​boutons.