Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

1. Voorbereiden Flame-afgesloten glazen Micropipet Met behulp van micro-elektrode glas, trek een standaard patch-clamp micropipet op een Flaming-Brown of gelijkwaardig micropipet trekker (tip diameter ~ 2 micrometer). Plaats micropipet tip in de vlam van een bunsenbrander voor ~ 2 sec tot een gesmolten bal vormen met een diameter van 200-300 urn. Plaats vlam afgedichte patch pipet op houder op een micromanipulator die snel kunnen worden getrild side-to-side (reisafstand 100 tot 200 micrometer) met behulp van een piëzo-elektrische bimorfe, relais, of een gelijkwaardig effectief apparaat. 2. Voorbereiden Brain Plakjes van P1-P21 ratten of muizen Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) met de volgende samenstelling (in mm): 124 NaCl, KCl 4,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, en 10 D-glucose. Bubble oplossing met 95% zuurstof / 5% CO 2-gas voor ~ 15 min, voeg dan 2 mM CaCl 2 en 1 mM MgCl 2. Snijden hersenen plakjes: Verdoven van dieren met halothaan of isofluraan. Onthoofden dier – verwijder brein – blokkeren hersenen in de gewenste richting (coronaal, parasagittal, dwars, enz.) om gebieden van belang zijn. Bevestig de geblokkeerde hersenen fase van een trillend hersenen slicer ondergedompeld in aCSF – sectie hersenen op 250 tot 400 micrometer dik – plaats plakken in aCSF borrelen met carbogen in een "pre-incubatie" kamer op verrekening die zorgt voor een soepele / gas exposure op alle oppervlakken – laten plakken in dit medium equilibreren voor ten minste een uur. 3. Vibrodissociation Vul een 35 mm diameter cultuur schotel met HEPES-gebufferde zoutoplossing oplossing van de volgende samenstelling (mm): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, een MgCl 2, 2,5 CaCl2, 10 D-glucose met een pH ingesteld op 7,4 met behulp van NaOH en osmolariteit aangepast aan ~ 300 mOsm met behulp van sucrose. Cultuur gerechten worden schorsing gerechten, standaard celkweek gerechten, cultuur gerechten met glazen dekglaasje inserts, of gerechten bedekt met, bijvoorbeeld, poly-L-lysine, afhankelijk van de behoefte aan sterkere cel naleving van de schotel bodem. Plaats de slice in de cultuur schotel en visualiseren met een dissectie stereoscoop bij 250 x. Houd slice naar de bodem met behulp van een gebogen platina draad (0,5 mm diameter) geplaatst op de bovenkant van de plak op te treden als een gewicht. Plaats de punt van de vlam afgesloten micropipet op de plak oppervlak in de gewenste hersengebied. Activeer micromanipulator naar de tip lateraal trillen op 10-30 Hz, met een excursie afstand van ~ 100 urn. Met behulp van de micromanipulator, verplaatst u de tip dieper in het plakje weefsel zodanig dat het door de hele slice binnen ~ 30 sec. Herhaal deze stap als nodig is om het aantal geïsoleerde neuronen te verkrijgen uit een bepaalde hersengebied te maximaliseren. Haal de tip van de slice – pick-up het segment met pincet en schud deze voorzichtig terwijl nog steeds in oplossing – dan volledig te verwijderen slice en gooi ze weg. Laat de gedissocieerde cellen om zich te vestigen en om de schotel bodem zich gedurende minstens 10 minuten. 4. Elektrofysiologische opname Plaats het schaaltje met neuronen op het podium van een omgekeerde microscoop en visualiseren met 10 x tot 63 x doelstelling. Kijk voor neuronen met een gladde patent membraan, geen blebbing, en een detecteerbaar, maar niet oversized kern. Als fase contrast optiek worden gebruikt, kijk voor fase-bright neuronen met een geel-tint, niet te blauw. Superfuse cellen met extracellulaire oplossing, die de gewenste zouten, voedingsstoffen, receptor antagonisten, etc. (onze standaard is de HEPES-gebufferde zoutoplossing bovengenoemde (paragraaf 3.1)), vaak aangevuld met 5 uM 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] chinoxaline-7-sulfonamide dinatrium (NBQX) en 25-100 uM D-2-amino-5-phosphonopentanoic zuur (AP5) om ionotrope glutamaat receptoren die het mogelijk maakt voor het isoleren van een snelle GABA te blokkeren Een receptor-gemedieerde IPSCs 1,2. Trek een standaard patch micropipet met behulp van een Flaming-Brown of gelijkwaardig trekker. Pipetpunt weerstand moet 2-4 MΩ (afhankelijk van de beoogde celgrootte) gevuld met een Cl – – ​​gebaseerde oplossing. Stel een whole-cell opname van een neuron gevisualiseerd met behulp van standaard elektrofysiologische technieken. Record spontane postsynaptische stroom (sPSCs) met behulp van een gap-free data-acquisitie protocol. Van toepassing zijn 0,2-1 uM tetrodotoxine en / of lage Ca 2 + – met extracellulaire oplossing voor miniatuur postsynaptische stromingen (mPSCs) record. Oplossingen en farmacologische middelen kunnen rechtstreeks worden toegepast op cellen. We maken gebruik van lokale superfusie van gesmolten vierkante getipt glazen buizen met een oplossing uitwisseling tussen zijwaartse beweging van de buis gemonteerd op een stappenmotor-motor aangedreven micromanipulator. Deze allowas voor oplossing uitwisseling in 10s tot 100s van ms tot snelle veranderingen in de extracellulaire moleculaire inhoud, toepassing van de receptor agonisten, enz. te bereiken Akaike en collega's hebben technieken ontwikkeld om te stimuleren een presynaptische boutons 3,4. Een micropipet is geplaatst in de buurt een gevisualiseerde Bouton en stimulans wordt gegeven (negatieve prikkel stromingen van 5-10 microAmpère, 0.1-0.2 ms duur). Unitaire IPSCs worden geregistreerd, en methoden zoals de methode van storingen kan worden gebruikt om veranderingen in de presynaptische en postsynaptische functie te onderzoeken. 5. Imaging presynaptische Terminals Postsynaptische neuronen kunnen gevuld worden met diverse kleurstoffen via de patch pipet. Neuronen kunnen ook worden gemaakt van muizen die fluorescerende eiwitten (KP's), zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) in de geselecteerde cel populaties. Presynaptische terminals kunnen worden gevisualiseerd op vibrodissociated neuronen gemaakt van muizen die KP's in het bijzonder interneuron populaties uit te drukken. Bijvoorbeeld, muizen die GFP gedreven door de glutamaat decarboxylase 65 (GAD65) promotor tonen groene somata en processen in de hippocampus mand cellen en andere interneuronen. Vibrodissociated piramidale neuronen uit de hippocampus CA1 regio GFP-positieve axon terminals apposed om hun somata en proximale dendrieten (Figuur 1A). Piramidale neuronen vibrodissociated van muizen die uitdrukken synaptopHlourin (een pH-gevoelige GFP mutant gefuseerd met het synaptische vesikel-geassocieerd VAMP2 eiwit) ook onder controle van de Thy1 promotor FP-positieve aangesloten boutons dat pH-gevoelige fluorescentie (Figuur 1B) show. Presynaptische boutons kunnen worden geladen met calcium indicator kleurstoffen en andere fluorescerende moleculen met behulp van AM-veresterde verbindingen 5. Figuur 2 toont een voorbeeld van het laden van het gebruik van de calcium-indicator kleurstof Fluo4-AM. De eerste, 1-2 uM AM-veresterde kleurstof wordt toegepast op neuronen bij 37 ° gedurende 10 minuten. Kleurstof kan dringen in de intracellulaire omgeving, waar esterases klieven het molecuul, waardoor vrij, cel-en impermeant ongelest kleurstof. Deze aanpak laadt zowel pre-en postsynaptische cellulaire elementen. Na het laden worden de cellen gewassen met HEPES-gebufferde zoutoplossing en bewaard bij 37 ° C gedurende een extra 10 minuten. Voorafgaand aan het maken van een GΩ-seal met een glazen pipet elektrode, zijn de cellen gespoeld 3 keer met externe gebufferde oplossing. A whole-cell opname wordt dan vastgesteld aan de hand van een kleurstof-vrije intracellulaire oplossing. Na 2-5 minuten van de opname, is de kleurstof grotendeels verwijderd uit de postsynaptische neuron, waardoor visualisatie van Fluo-4-geladen synaptische boutons. Deze techniek is ontwikkeld door Ye et al. 5. De kleurstof-geladen boutons kan vervolgens worden gevisualiseerd met behulp van een hoge vergrotingsfactor, een hoge numerieke apertuur objectief met ofwel een camera-of multifoton microscoop. Gelijktijdig whole-cell opname en calcium beeldvorming kan worden bereikt met een opstelling zoals weergegeven in figuur 3. De beelden van de neuron en boutons weergegeven in figuur 2C werden gevangen met een elektron te vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EMCCD) camera. De kracht van de lichtbron voor excitatie was verzwakte tot 1,2%, met een neutrale dichtheid van 1,0 filter en een iris-filter ingesteld op 12% vermogen. Calcium transiënten van de groene presynaptische boutons kunnen worden geobserveerd en geregistreerd in real time, en gemeten offline. 6. Representatieve resultaten: Spontane en Current Injection-Evoked afvuren van Vibrodissociated Neuronen Opnames van een typische vibrodissociated hippocampal CA1 pyramidale neuron zijn weergegeven in figuur 4A. Spontane overschrijding actiepotentialen kunnen worden waargenomen in piramidale neuronen los te zien van de rat basolaterale amygdala, hippocampus en de VTA 1,5. Tijdens de current-clamp opnamen van CA1 pyramidale neuronen, hyperpolarizing huidige injectie levert een typische spanning de reacties, terwijl depolariserende stroom van voldoende omvang overschrijding actiepotentialen te lokken met de typische vertraagde vuurpatroon met matige huidige niveaus en niet-meegaand actiepotentialen in reactie op de sterkere stroom te injecteren ( Figuur 4B). Spontane en Miniatuur GABAergische remmende postsynaptische Stromingen in Vibrodissociated Neuronen Tijdens de voltage-clamp opnamen met een CsCl-gebaseerde intracellulaire oplossing, zijn spontane synaptic stromingen waargenomen (figuur 5A). Deze gebeurtenissen worden geëlimineerd in lage calcium-bevattende oplossing 2,6, en in de meeste neuronale types zijn volledig geblokkeerd door de GABA-A receptor antagonisten, zoals bicuculline of gabazine (Figuur 5B, C), wat aangeeft dat deze sIPSCs gemedieerd door GABA release en activering van deze ionotrope receptor subtype. Echter, in principe neuronen van de hersenen regio's zoals de basolaterale amygdala 2 en het ventrale tegmentale gebied 5,7, GABA-A receptor blokkadeonthult kortere duur EPSCs gemedieerd door glutamaat activering van AMPA-type receptoren. Interessant is dat de toepassing van TTX bij concentraties die specifiek zijn voor blokkade van de meest toxine-gevoelige voltage-gated natriumkanalen vermindert de frequentie en amplitude van de sIPSCs waargenomen in vibrodissociated neuronen uit verschillende gebieden van de hersenen (figuur 6A) 2,4,7. Zo, natrium-kanaal activiteit neemt deel aan GABA release in de beknelde-off synaptische boutons. Het is nog niet duidelijk of full-blown natrium actiepotentialen optreden in deze terminals. Het is vermeldenswaard dat de ingangsweerstand van een goed afgesloten 1 uM diameter axon terminal is waarschijnlijk tot ver in de GΩ bereik. Zo zou de opening van zelfs een klein aantal van de natriumkanalen voldoende op de klemmen depolariseren de calcium kanalen die excitatie secretie koppeling bemiddelen activeren. Over het onderwerp van deze calcium-kanalen zijn er aanwijzingen dat N en P / Q-type kanalen deel te nemen in release op GABA-erge terminals in de vibrodissociated voorbereidingen van de hippocampus CA1 en elders 8. Modulatie en plasticiteit van overdracht door een aantal neurotransmitters en receptoren is onderzocht met behulp van vibrodissociated neuronen 3,4,9. De neurotransmitters aangetoond dat dergelijke modulerende acties zijn adenosine, GABA, serotonine, endocannabinoïden, etc 2,6,10,11,12. Daarnaast heeft de korte termijn synaptische plasticiteit, zoals endocannabinoïde-afhankelijke depolarisatie-geïnduceerde onderdrukking van de inhibitie (DSI) ook beschreven in dit preparaat 2,11. Deze bevindingen wijzen erop dat vele vormen van receptor-gemedieerde en trans-synaptische signalering door endogene neuromodulatoren intact zijn in de vibrodissociated voorbereiding. Calcium transiënten en vesiculaire Release in Axon Terminals in de Vibrodissociated Preparation Met behulp van de EMCCD uitgeruste omgekeerde microscoop hierboven beschreven, hebben we onderzocht calcium transiënten in presynaptische terminals in de vibrodissociated neuron-Bouton voorbereiding. Figuur 2 toont cel laden met AM-veresterde Fluo-4 en de daarop volgende postsynaptische kleurstof verdunning in een hippocampal CA1 piramide neuron. Spontane calcium transiënten zijn waargenomen bij sommige dye-gevulde boutons getoond als regio's van belang (ROI) in figuur 6B. Toepassing van een uM tetrodotoxine (TTX) elimineert deze spontane transiënten, waaruit blijkt dat zij worden gemedieerd door activering van voltage-gated sodium stromingen die spontaan worden geactiveerd in boutons, wat leidt tot de volgende calcium stijgt. Het verhogen van extracellulaire KCl van 10 mm tot 40 mm met een snelle oplossing uitwisseling een verhoogde fluorescentie gemeten in ROI die overeenkomen met de presynaptische terminals (Figuur 7A). Gelijktijdige opname van het postsynaptische neuron wordt gebruikt voor het sIPSCs volgen en indien event frequentie wordt verhoogd door een hoge-K + depolarisatie (Figuur 7B) te bepalen. Te visualiseren blaasje fusie in de presynaptische boutons we hebben gebruikt muizen die de synaptopHlourin bouwen onder de controle van de Thy1 promoter (het label spH21 muizen). SynaptopHluorin in een moleculaire constructie waarin de ecliptica pHlourin (een GFP-mutant met een verhoogde pH-gevoeligheid) 12 is gekoppeld aan het blaasje bijbehorende membraaneiwit (VAMP2) 13. Deze regeling situeert de pHlourin motief in de vesicle lumen, waar het relatief zure omgeving lest fluorescentie. Bij het blaasje fusion dit motief is blootgesteld aan de meer neutrale extracellulaire omgeving met een daaruit voortvloeiende toename van de fluorescentie bij puncta die overeenstemmen met blaasjes / presynaptische terminals. Vibrodissociation van hippocampale neuronen van spH21 muizen zorgt voor visualisatie van fluorescerende puncta van de grootte en de locatie verwacht voor GABA-erge terminals (Figuur 8A). Toepassing van de hoge-K + – met een externe oplossing verhoogt fluorescentie in deze terminals, en dit effect is geblokkeerd in de aanwezigheid van een externe oplossing waarbij extracellulair calcium wordt gereduceerd tot 0,2 mm (Figuur 8B). Zo is de depolarisatie-geïnduceerde toename in fluorescentie blijkt excitatie-secretie koppeling reflecteren op GABA-erge synapsen in de neuron-Bouton voorbereiding. De mogelijkheid om presynaptische calcium transiënten en blaasje fusie in axon terminals van het neuron-Bouton voorbereiding maat stelt ons in staat om te onderzoeken effecten van neuromodulatoren, drugs en synaptische plasticiteit op presynaptische mechanismen betrokken bij excitatie-secretie koppeling en exocytose / endocytose. Deze technieken kunnen ook worden gecombineerd met andere moleculaire technieken en de genetisch gemanipuleerde muizen om de rol van specifieke eiwitten in presynaptische functie en modulatie / plasticiteit onderzoeken. Figuur 1. Vibrodissociated neuronen van de hippocampus CA1 regio (A) samengevoegde afbeelding van DIC eennd groene fluorescentie beelden van een GAD65 muis. DIC beeld wordt samengevoegd worden duidelijk de locaties van de groene terminals (B) Fluorescentie beeld uit een synaptophluorin (spH21) muis. Schaalbalk = 10 micrometer Figuur 2 Calcium indicator-loading procedure: (A) hele cel is geladen met AM-veresterde kleurstof; (B) whole-cell opname verdunt kleurstof; (C) terminals worden gevisualiseerd als regio's van belang (pijlpunten).. Figuur 3. Schematische weergave van de experimentele opstelling voor gelijktijdige whole-cell imaging opname en calcium in presynaptische terminals op vibrodissociated neuronen. EMCCD = elektron te vermenigvuldigen Charge Coupled Device. Figuur 4. Vertegenwoordiger van golfvormen zien (A) spontane actiepotentialen van een vibrodissociated CA1 neuron en (B) membraan spanning reacties op hyperpolarizing en depolariserende stroom injecties in de huidige-clamp opnamen van een CA1 neuron. Figuur 5. (A) Vertegenwoordiger golfvormen van spontane IPSCs uit een CA1 piramide neuron. (BC) De IPSCs werden geblokkeerd door een van beide gabazine (10 uM, B) of bicuculline (20 micrometer, C). Figuur 6. TTX remt de spontane GABAergische synaptische transmissie, en elimineert presynaptische calcium transiënten in de hippocampus vibrodissociated voorbereiding. (A) Opnemen van een vibrodissociated neuron voor en tijdens de TTX applicatie. Let op de afname van de frequentie en amplitude van sIPSCs. (B) Calcium passanten waargenomen in een Fluo-4-geladen presynaptische terminal op een vibrodissociated neuron voor en tijdens de TTX applicatie. Let op de volledige verlies van de transiënten. Figuur 7. Gelijktijdige calcium indicator beeldvorming en sIPSC whole-cell opnemen met effecten van hoge K + stimulatie. (A) Fluorescentie gemeten over de tijd uit een presynaptische bouton geladen met Fluo-4AM kleurstof. (B) gelijktijdige toename van sIPSC frequentie en amplitude tijdens hoge K +-toepassing. Figuur 8. Ca 2 +-afhankelijke high-K + reactie in presynaptische boutons van spH21 piramidale neuronen uit de hippocampus CA1 regio. (A) Fluorescentie beeld van een vibrodissociated neuron. (B) High-K + toepassing (aangeduid door de zwarte balk) resulteerde in een aanhoudende toename van de fluorescentie in het bijzijn van onze normale extracellulaire Ca 2 +-bevattende oplossing (2 mM Ca2 +). Geen fluorescentie stijging werd waargenomen bij lage extracellulaire Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +). De gegevens in grafiek werden genormaliseerd om pre-high-K + fluorescentie levels, en tonen de gemiddelde reactie van 3 boutons.