Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي
Summary
هذا التقرير يوضح تقنية لعزل الخلايا العصبية ميكانيكية قابلة للحياة الفردية الاحتفاظ حبات قبل المشبكي المرفقة. Vibrodissociated الخلايا العصبية لديها مزايا الإنتاج السريع ، ومراقبة الدوائية ممتازة وتحسين الفضاء المشبك دون تأثير من الخلايا المجاورة. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتصوير وتسجيل العناصر متشابك التصحيح ، المشبك.
Abstract
الميكانيكي تفكك الخلايا العصبية من الجهاز العصبي المركزي لديه ميزة أن حبات قبل المشبكي تظل تعلق على الخلايا العصبية معزولة من الفائدة. وهذا يسمح للفحص انتقال متشابك في ظل الظروف التي يمكن فيها للبيئات خارج الخلية بعد المشبكي وتسيطر عليها بشكل جيد داخل الخلايا. وهناك تقنية الاهتزاز المستندة دون استخدام البروتياز ، والمعروفة باسم vibrodissociation ، هو الأسلوب الأكثر شعبية بالنسبة للعزلة الميكانيكية. يتم وضع micropipette ، مع تلميح النار مصقولة على شكل كرة صغيرة ، إلى شريحة الدماغ مصنوعة من القوارض P1 P21. هو صدي للmicropipette موازية لسطح شريحة وخفضت من خلال شريحة سمك مما أدى إلى التحرر من الخلايا العصبية معزولة. الخلايا العصبية معزولة مستعدون للدراسة في غضون دقائق قليلة من vibrodissociation. هذه التقنية على استخدام مزايا الثقافات العصبية الأولية ، وشرائح الدماغ والخلايا العصبية معزولة إنزيمي بما في ذلك : الإنتاج السريع للخلايا العصبية ، قابلة للحياة ناضجة نسبيا المناسبة للدراسة الكهربية والتصوير ، والسيطرة متفوقة على البيئة خارج الخلية خالية من تأثير الخلايا المجاورة ؛ ملاءمة لجيد للرقابة الدوائية التجارب باستخدام التطبيق السريع والكامل للمخدرات superfusion الخلية ؛ وتحسين الفضاء المشبك في خلية كاملة التسجيلات المتعلقة الخلايا العصبية في شريحة أو مستحضرات ثقافة الخلية. ويمكن استخدام هذا الإعداد لدراسة متشابك الفيزيولوجيا وعلم الصيدلة وتعديل واللدونة. في الوقت الحقيقي التصوير كل من العناصر السابقة وبعد المشبكي في الخلايا الحية وحبات من الممكن أيضا استخدام الخلايا العصبية vibrodissociated. ويمكن أيضا توصيف المكونات الجزيئية من العناصر قبل وبعد المشبكي أن يتحقق مع النهج المناعية والتصوير القائم.
Protocol
Discussion
vibrodissociation الناجحة تتطلب أن شرائح تحتوي على الخلايا العصبية السليمة والتي مسافات خلالي مرنة بما فيه الكفاية للسماح للخلايا العصبية للخروج من دون وقوع خسائر شريحة سامة. وبالتالي ، فإن التقنية تعمل بشكل أمثل في سن مبكرة بعد الولادة (P1 – 21) عندما يمكن جعل شرائح صحية بمواد أقل الدبقية / interstiatial مما هو موجود في شرائح الدماغ الكبار. في تجربتنا ، ومع ذلك ، وتحسين إعداد شريحة لبقاء الخلايا العصبية في الشريحة نفسها قد تكون عكسية لتقنية vibrodissociation. بينما نحن نستعد بشكل روتيني للشرائح في تسجيل الموقع باستخدام الباردة aCSF تعديل الذي تم استبداله السكروز لكثير من نا + كا 2 خارج الخلية ويمكن تحضير + والشرائح التي أعدت لvibrodissociation (مثل قطع) في aCSF لدينا تسجيل العادي. عندما تستعد لتسجيل شرائح من الخلايا العصبية الفردية في شرائح أنفسهم أيضا نضع الشرائح في aCSF الطبيعي بنحو 35 درجة مئوية بعد sectioning وتركهم ل30-60 دقيقة في هذه الحرارة قبل أن تعيدهم إلى درجة حرارة الغرفة. ومع ذلك ، يتم نقل شرائح أعدت للvibrodissociation فورا إلى درجة حرارة الغرفة بعد تشريح. هذه الإجراءات توفير عائدات أعلى من الخلايا العصبية السليمة vibrodissociation بعد ، ربما بسبب عدم وجود شركة النسيج الخلالي الذي يسمح الخلايا العصبية أكثر سهولة اهتزت فضفاض من الشريحة نفسها. نحن لم درست باستفاضة الظروف إعداد شريحة ، ونحصل على ما يكفي من الخلايا العصبية بشكل روتيني لتسجيل لدينا وتجارب التصوير في يوم معين. فمن الممكن أن يمكن إجراء تعديلات إضافية ، مثل التغييرات في سمك شريحة أو إجراءات preincubaton ، لزيادة الغلة من الخلايا العصبية السليمة. وقد حاول العلاج البروتيني خفيفة جدا في محاولة لزيادة الغلة الخلية والحصول على تقنية العمل في الحيوانات الاكبر سنا. ومع ذلك ، دائما العلاج حتى البروتيني خفيفة يبدو لتعطيل وظيفة المشبك. وهكذا ، في حين أن مجموعة من البروتيني والميكانيكية قد لا يزال تفارق يمكن العثور على العمل الذي لم يثبت الخلايا العصبية في الدماغ المقدم موثوق بها حتى الآن.
وينبغي أيضا أن يكون لاحظت العائد المنخفض نسبيا من الخلايا العصبية السليمة بعد vibrodissociation يعني أن التقنية مفيدة بشكل رئيسي لدراسة فرعية العصبية وفيرة ، والإسقاط الخلايا العصبية في المقام الأول. توافر GFP – معربا عن الفئران التي يمكن من خلالها مجموعات سكانية فرعية صغيرة الخلايا العصبية التي تم تحديدها بسهولة يزيد من فرصة لدراسة هذه الخلايا العصبية النادرة. ومع ذلك ، ما لم يمكن تحسين العائد الخلايا العصبية بشكل كبير من البيانات عن تراكم هذه الخلايا العصبية من المرجح أن يكون بطيئا نسبيا.
وقد أثبتت العديد من الخطوات لتكون حاسمة بالنسبة لنجاح التحميل من الخلايا العصبية مع الكالسيوم للاستشعار الأصباغ. يتم تنفيذ التعرض لAM – أسترته صبغ عند 37 درجة مئوية ، وأننا لم ننجح في محاولة لصبغ تحميل عند درجات حرارة منخفضة. وينبغي أن يكون الأمثل للتركيز الأصباغ اعتبار كل وقت التحميل ودرجة الحرارة منذ يبدو أن تركيز أعلى من تحميل وصبغ يقلل تركيز الكالسيوم في حبات قبل المشبكي. وقد لاحظنا أن تحميل مع تركيزات أعلى انخفاض وتيرة واتساع sIPSCs. عند تحميل الكالسيوم في محطات الاستشعار عن الصبغات من الخلايا العصبية قبل المشبكي vibrodissociated يجب أخذ الحيطة والحذر بسبب التخزين المؤقت قدرة حبات من قبل المشبكي الصغيرة قد تكون مختلفة عما كانت عليه في سوما وأحجام حبات ليست متسقة. تغسل الأطباق التي تحتوي على الخلايا العصبية مع HEPES – مخزنة حل الخارجية بعد تحميل وصباغة ، ووقت الشفاء بعد الغسيل أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، لجعل ختم جيدة لتسجيل كامل الخلية ، يجب غسلها جيدا الخلايا للتخلص من جزيئات غير المنضوية الصبغة من الغشاء الخلوي الخارجي.
بالإضافة إلى استخدام الخلايا العصبية vibrodissociated للتصوير الخلايا الحية والكهربية ، ويمكن أيضا تقنيات immunocytochemical يمكن تطبيقها على هذه الخلايا 11،12. ويمكن بسهولة الخلايا الثابتة والملون مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ، وعلامات خلية أخرى. استخدام هذه الخلايا يوفر إعداد التصور نظيفة للتعبير البروتين في محطات قبل المشبكي GABAergic. استخدام الفئران التي تعبر عن البروتينات الفلورية تحت سيطرة المروجين محددة لGABAergic الخلايا العصبية يسمح للمحقق لتحديد محطات متشابك الفردية في إعداد وvibrodissociated (الشكل 1). قد علامات الفلورسنت التصوير من هذا النوع تسمح القياسات المورفولوجية في المحطات باستخدام الليزر القائمة على أحدث التقنيات والمجهري مثل STED (الميكروسكوب تحفيز استنفاد الانبعاث). التصور مع الأصباغ ذلك التقرير الدراجات حويصلة متشابك من الممكن أيضا مع هذا الإعداد. وصفت Akaike وزملاء العمل مع محطات GABAergic الصبغة styryl ، FM1 – 43 لتصور محطات في الخلايا الحية 4.
ينبغي أن يكون من الممكن أيضا لأداء وحيدة الخلية المنتسخة العكسية PCR RNA التعبير في ملف vibrodissociatedالخلايا العصبية. يتم تطبيق هذه التقنية بشكل روتيني إلى إنزيمي – نأت الخلايا العصبية والخلايا العصبية التي تزرع في المزارع الخلوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف الدكاترة. يونيو بينغ تشو وكوياما سوسومو على المساعدة التي قدموها أثناء إعداد الأولي للتقنية ، والدكتور فيرونيكا الفاريز من أجل المساعدة في تنسيق مخطوطة مكتوبة. وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل شعبة البحوث السريرية وجماعية من NIAAA الطبية الحيوية.
Materials
| Item | Company | Catalog# | Comments |
| Vibrating Tissue Slicer | Leica Microsystems Inc. | VT1200S | |
| Cell Culture Dish (35 mm) | BD Falcon | 353001 | |
| Glass Bottom Dishes | Willco-dish | GWSB-5040 Or GWSB-3522 | 0.16-0.19 mm glass thickness for imaging |
| Piezoelectric Manipulator | Exfo-Burleigh | LSS-3000 | Could also use relay, etc. |
| SD9 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | SD9K | For triggering piezoelectric manipulator |
| Dissecting Stereoscope | Wild Heerbrugg | TYP 374590 | Could also use any stereoscope |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW-150F-4 | For flame-sealed glass micropipette and patch micropipette |
| Six Channel Perfusion Valve Control Systems | Warner Instruments | VC-6 or VC-6M | |
| Perfusion Fast-Step | Warner Instruments | SF-77B | |
| Inverted Microscope with 20-63x objectives | Nikon | TS200 Diaphot | |
| EMCCD Camera | ANDOR Technology | iXonEM+ DU-888 | |
| Excite Fluorescence Illumination Light Source | EXFO Photonics Solutions Inc. | X-Cite 120PC | |
| Fluo-4, AM calcium indicator | Molecular Probes | F14201 |
References
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Ethanol potentiates gabaergic synaptic transmission in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurophysiol. 96, 433-441 (2006).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Retrograde endocannabinoid signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from basolateral amygdala. J Neurosci. 25, 6199-6207 (2005).
- Akaike, N., Moorhouse, A. J. Techniques: Applications of the nerve-bouton preparation in neuropharmacology. Trends Pharmacol Sci. 24, 44-47 (2003).
- Akaike, N., Murakami, N., Katsurabayashi, S., Jin, Y. H., Imazawa, T. Focal stimulation of single gabaergic presynaptic boutons on the rat hippocampal neuron. Neurosci Res. 42, 187-195 (2002).
- Ye, J. H., Wang, F., Krnjevic, K., Wang, W., Xiong, Z. G., Zhang, J. Presynaptic glycine receptors on gabaergic terminals facilitate discharge of dopaminergic neurons in ventral tegmental area. J Neurosci. 24, 8961-8974 (2004).
- Koyama, S., Matsumoto, N., Kubo, C., Akaike, N. Presynaptic 5-ht3 receptor-mediated modulation of synaptic gaba release in the mechanically dissociated rat amygdala neurons. J Physiol. 529, 373-383 (2000).
- Deng, C., Li, K. Y., Zhou, C., Ye, J. H. Ethanol enhances glutamate transmission by retrograde dopamine signaling in a postsynaptic neuron/synaptic bouton preparation from the ventral tegmental area. Neuropsychopharmacology. 34, 1233-1244 (2009).
- Murakami, N., Ishibashi, H., Katsurabayashi, S., Akaike, N. Calcium channel subtypes on single gabaergic presynaptic terminal projecting to rat hippocampal neurons. Brain Res. 951, 121-129 (2002).
- Zhu, P. J., Lovinger, D. M. Persistent synaptic activity produces long-lasting enhancement of endocannabinoid modulation and alters long-term synaptic plasticity. J Neurophysiol. 97, 4386-4389 (2007).
- Inada, H., Maejima, T., Nakahata, Y., Yamaguchi, J., Nabekura, J., Ishibashi, H. Endocannabinoids contribute to metabotropic glutamate receptor-mediated inhibition of gaba release onto hippocampal ca3 pyramidal neurons in an isolated neuron/bouton preparation. Neuroscience. 165, 1377-1389 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptophluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6131-6136 (2005).
