Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

1. Preparazione di fiamma Sealed Glass Micropipetta Utilizzando il vetro microelettrodo, tirare una serie di patch-clamp micropipetta su un Flaming-Brown o equivalente micropipetta estrattore (punta diametro ~ 2 micron). Micropipetta luogo punta nella fiamma di un becco Bunsen per ~ 2 sec fino a quando si forma una palla fusa con un diametro di 200-300 micron. Luogo fiamma sigillato pipetta cerotto sulla titolare su un micromanipolatore che possono essere rapidamente vibrato da lato a lato (distanza viaggio 100-200 micron) utilizzando un piezoelettrico bimorfi, relè, o un dispositivo equivalente efficace. 2. Preparazione di sezioni di cervello da P1-P21 ratti o topi Preparare artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) con la seguente composizione (in mm): 124 NaCl, 4.5 KCl, 1.2 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, e 10 D-glucosio. Soluzione bolla con il 95% di ossigeno / 5% CO 2 gas per circa 15 minuti, quindi aggiungere 2 mM CaCl 2 e 1 mM MgCl 2. Taglio fette di cervello: Anestetizzare animali con alotano o isofluorano. Decapitare animali – rimuovere cervello – cervello blocco nella posizione desiderata (coronale, parasagittale, trasversale, ecc) per includere le regioni di interesse. Fissare il cervello bloccato allo stadio di una affettatrice cervello vibrante immersa in aCSF – cervello sezione a 250-400 micron di spessore – fette posto in aCSF bollito con CarboGen in una camera "preincubazione" sulla rete che consente di fluido / esposizione a gas su tutte le superfici – permettono fette di equilibrare in questo mezzo per almeno un'ora. 3. Vibrodissociation Riempire un piatto di diametro 35 millimetri cultura con HEPES-soluzione salina tamponata della seguente composizione (mm): 150 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2.5 CaCl 2, 10 D-glucosio con pH impostato a 7,4 con NaOH e osmolarità regolato ~ 300 mOsm mediante saccarosio. Piatti la cultura può essere piatti sospensione, standard piatti di coltura cellulare, capsule di Petri con inserti in vetro coprioggetti, o piatti rivestiti con, ad esempio, poli-L-lisina, a seconda delle necessità di aderenza delle cellule più forte per il fondo piatto. Mettere la fetta nel piatto cultura e visualizzare con uno stereoscopio dissezione a 250 x. Tenere fetta sul fondo con un filo di platino piegato (0,5 mm di diametro) posto sulla superficie superiore della fetta di agire come un peso. Posizionare la punta della fiamma sigillato micropipetta sulla superficie di sezione nella regione del cervello desiderato. Attivare micromanipolatore a vibrare la punta laterale a 10-30 Hz, con la distanza escursione ~ 100 micron. Utilizzando il micromanipolatore, spostare la punta più in profondità nel tessuto fetta tale che passa attraverso la fetta intera entro ~ 30 sec. Ripetere questo passaggio come necessario per massimizzare il numero di neuroni isolati ottenibili da una regione del cervello dato. Rimuovere la punta dal fetta – raccogliere la fetta con una pinza e scuoterla delicatamente mentre è ancora in soluzione – quindi rimuovere fetta completamente e scartare. Consentire alle cellule dissociate di stabilirsi e di aderire al fondo piatto per almeno 10 min. 4. Registrazione elettrofisiologiche Porre la capsula che contiene i neuroni sul palcoscenico di un microscopio invertito e visualizzare con 10 x di 63 x obiettivo. Cercare i neuroni con una membrana brevetto liscio, non blebbing, e un nucleo rilevabile, ma non di grandi dimensioni. Se ottica a contrasto di fase sono utilizzate, per cercare di fase luminosa neuroni con una sfumatura giallo-, non troppo blu. Superfuse cellule con soluzione extracellulare contenente sali desiderato, sostanze nutritive, antagonisti dei recettori, ecc (il nostro standard è la soluzione salina HEPES-buffered di cui sopra (sezione 3.1)), spesso integrato con 5 mM 2,3-diosso-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] chinossalina-7-sulfonamide mM disodico (NBQX) e 25-100 D-2-amino-5-phosphonopentanoic acido (AP5) per bloccare i recettori del glutammato ionotropici che consente l'isolamento di digiuno GABA Un recettore-mediata iPSCs 1,2. Tirare una micropipetta normale cerotto con un estrattore Flaming-Brown o equivalente. Pipetta resistenza punta dovrebbe essere di 2-4 MΩ (a seconda delle dimensioni delle cellule bersaglio) quando è riempita con un Cl – – ​​soluzione basata. Stabilire una cellula intera registrazione da un neurone osservata con tecniche elettrofisiologiche. Record spontanee correnti post-sinaptiche (sPSCs) con un gap-free di acquisizione dati di protocollo. Applicare 0,2-1 mM tetrodotossina e / oa basso Ca 2 + – che contiene la soluzione extracellulare per registrare in miniatura correnti post-sinaptiche (MPSCS). Soluzioni e agenti farmacologici può essere applicato direttamente alle cellule. Noi usiamo superfusione locali da fuso piazza punta tubi di vetro con scambio soluzione che comporti il ​​movimento laterale del tubo montato su un motore passo-passo-driven micromanipolatore. Questo alloera per lo scambio di soluzione in 10s a 100s di ms per ottenere rapidi cambiamenti extracellulare contenuto molecolare, l'applicazione di agonisti del recettore, ecc Akaike e colleghi hanno sviluppato tecniche per stimolare singolo boutons presinaptica 3,4. Una micropipetta è posizionato vicino a una bouton visualizzati e la stimolazione è data (correnti stimolo negativo di 5-10 μA, 0,1-0,2 ms di durata). IPSCs unitario sono registrati, e metodi come il metodo di guasti può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti nella funzione presinaptica e postsinaptica. 5. Terminali Imaging Presinaptico Neuroni postsinaptici possono essere riempiti con coloranti diversi tramite la pipetta di patch. I neuroni possono essere fatte anche da topi che esprimono proteine ​​fluorescenti (PQ), come la proteina fluorescente verde (GFP) in selezionati popolazioni cellulari. Terminali presinaptici possono essere visualizzati sui neuroni vibrodissociated a base di topi che esprimono PQ nelle popolazioni interneurone particolare. Per esempio, i topi che esprimono GFP guidata dal glutammato decarbossilasi 65 (GAD65) mostrano somata promotore verde e dei processi nelle cellule dell'ippocampo basket e altri interneuroni. Vibrodissociated neuroni piramidali della regione CA1 dell'ippocampo sono GFP-positive terminali degli assoni apposto la loro somata e dendriti prossimali (Figura 1A). Neuroni piramidali vibrodissociated da topi che esprimono synaptopHlourin (un pH-sensibile GFP mutante fusa alla vescicola sinaptica associata alla proteina VAMP2) sotto il controllo del promotore Thy1 anche boutons FP-positivo allegato che mostrano fluorescenza sensibile al pH (Figura 1B). Boutons presinaptico può essere caricato con coloranti indicatore di calcio e di altre molecole fluorescenti con AM-esterificati composti 5. La Figura 2 mostra un esempio di carico con il calcio-colorante indicatore Fluo4-AM. In primo luogo, 1-2 mM AM-esterificati colorante viene applicato ai neuroni a 37 ° per 10 min. Colorante in grado di penetrare nell'ambiente intracellulare, dove esterasi fendere la molecola, dando libero, colorante cellule impermeant e inappagata. Questo approccio carichi sia gli elementi pre-e post-sinaptici cellulare. Dopo il caricamento, le cellule vengono lavate con HEPES-soluzione salina tamponata e mantenuta a 37 ° per altri 10 min. Prima di effettuare un GΩ-sigillo con un elettrodo pipetta di vetro, le cellule vengono risciacquati 3 volte con esterni soluzione tamponata. Una cellula intera registrazione è stabilita utilizzando un colorante senza soluzione intracellulare. Dopo 2-5 minuti di registrazione, il colorante è in gran parte rimossa dal neurone postsinaptico, consentendo la visualizzazione di boutons sinaptica Fluo-4-caricate. Questa tecnica è stata introdotta da Ye et al 5. Il colorante-caricato boutons possono poi essere visualizzati con un alto ingrandimento, alto obiettivo apertura numerica sia con un microscopio fotocamera-based o multiphoton. Simultanea a cellula intera registrazione e l'imaging di calcio può essere raggiunto utilizzando una configurazione come mostrato nella Figura 3. Le immagini del neurone e boutons mostrato nella figura 2C sono stati catturati con un dispositivo elettronico moltiplicando accoppiamento di carica (EMCCD) fotocamera. La potenza della sorgente di luce per l'eccitazione era attenuato a 1,2% con un filtro a densità neutra 1,0 e un filtro iris regolata al 12% in uscita. Transitori di calcio dal verde boutons presinaptico possono essere osservati e registrati in tempo reale, e misurato non in linea. 6. Rappresentante dei risultati: Spontanea e corrente di iniezione-Evocati dei neuroni Vibrodissociated Registrazioni da una tipica vibrodissociated neuroni piramidali CA1 dell'ippocampo sono mostrati in Figura 4A. Potenziali d'azione spontanei superamento può essere osservato nei neuroni piramidali dissociato dal ratto basolaterale dell'amigdala, dell'ippocampo e VTA 1,5. Durante il corso-clamp registrazioni da neuroni piramidali CA1, iperpolarizzante iniezione di corrente produce risposte tensione tipica, mentre le correnti depolarizzanti di ampiezza sufficiente suscitare potenziali d'azione superamento con il modello tipico cottura ritardato con moderati livelli attuali e non ospitare potenziali d'azione in risposta alla forte iniezione di corrente ( Figura 4B). Spontanea e in miniatura GABAergici correnti inibitorie postsinaptici nei neuroni Vibrodissociated Durante voltage-clamp registrazioni con un CsCl soluzione basata intracellulare, spontaneo correnti sinaptiche sono osservati (Figura 5A). Questi eventi sono eliminati in basso contenenti calcio soluzione di 2,6, e nella maggior parte dei tipi di neuroni sono completamente bloccate da antagonisti dei recettori GABA A come bicucullina o gabazine (Figura 5B, C), indicando che questi sono sIPSCs mediata dal rilascio di GABA e l'attivazione di questo sottotipo recettoriale ionotropici. Tuttavia, nei neuroni principali da regioni cerebrali come l'amigdala basolaterale 2 e l'area ventrale tegmentale 5,7, blocco dei recettori GABA Arivela EPSCs durata inferiore glutammatergica mediata dall'attivazione di recettori AMPA-tipo. È interessante notare che l'applicazione di TTX a concentrazioni che sono specifici per il blocco della maggior parte della tossina sensibili voltaggio-dipendenti canali del sodio riduce la frequenza e l'ampiezza del sIPSCs osservato nei neuroni vibrodissociated da regioni cerebrali diverse (Figura 6A) 2,4,7. Così, l'attività del canale sodio partecipa a rilascio di GABA nel boutons sinaptica pizzicato-off. Non è ancora chiaro se in piena regola potenziali d'azione di sodio si verificano in questi terminali. Vale la pena notare che la resistenza di ingresso di un ben chiuso 1 terminale assone diametro mM è probabile che sia anche nella gamma GΩ. Così, l'apertura anche di un piccolo numero di canali del sodio potrebbe essere sufficiente per depolarizzare terminali per attivare i canali di calcio che mediano la secrezione di accoppiamento eccitazione. A proposito di questi canali del calcio, l'evidenza suggerisce che N e P / Q-type canali partecipare a rilasciare ai terminali GABAergici nella preparazione vibrodissociated da CA1 dell'ippocampo e altrove 8. Modulazione e la plasticità della trasmissione da una serie di neurotrasmettitori e recettori è stata esaminata utilizzando i neuroni vibrodissociated 3,4,9. I neurotrasmettitori dimostrato di avere le azioni modulatori quali sono adenosina, GABA, serotonina, gli endocannabinoidi, ecc 2,6,10,11,12. Inoltre, a breve termine plasticità sinaptica, come endocannabinoide-dipendenti depolarizzazione indotta soppressione di inibizione (DSI) è stata descritta anche in questa preparazione 2,11. Questi risultati indicano che molte forme di recettore-mediata e trans-sinaptica segnalazione da neuromodulatori endogeni sono intatte nella preparazione vibrodissociated. Transienti di calcio e di rilascio vescicolare Terminal Axon nella preparazione Vibrodissociated Utilizzando il EMCCD attrezzato microscopio invertito descritto sopra, abbiamo esaminato transienti di calcio in terminali presinaptici nel vibrodissociated neurone-Bouton preparazione. La Figura 2 mostra carico cella con AM-esterificati diluizione colorante Fluo-4 e la successiva post-sinaptici in un neurone piramidale CA1 dell'ippocampo. Transienti di calcio spontanee sono osservati in alcuni coloranti pieno boutons mostrato come regioni di interesse (ROI) in Figura 6B. Applicazione di 1 mM tetrodotossina (TTX) elimina questi transitori spontanee, indicando che essi sono mediati dall'attivazione del voltaggio-dipendenti delle correnti di sodio che sono spontaneamente attivati ​​in boutons, portando ad aumenti di calcio successive. L'aumento KCl extracellulare da 10 mm a 40 mm con lo scambio soluzione rapida produce un aumento della fluorescenza misurata in ROI che corrispondono ai terminali presinaptici (Figura 7A). Registrazione simultanea dal neurone postsinaptico viene utilizzato per monitorare sIPSCs e determinare se la frequenza di eventi è aumentato di alta depolarizzazione K + (Figura 7B). Per visualizzare la fusione delle vescicole nel boutons presinaptico abbiamo utilizzato topi che esprimono il synaptopHlourin costruire sotto il controllo del promotore Thy1 (etichettato spH21 topi). SynaptopHluorin in un costrutto molecolare, in cui eclittica pHlourin (un mutante GFP con pH maggiore sensibilità) 12 è legato alla proteina associata vescicola membrana (VAMP2) 13. Questa disposizione colloca il motivo pHlourin nel lume delle vescicole dove l'ambiente relativamente acido spegne fluorescenza. Su fusione delle vescicole questo motivo è esposto l'ambiente più neutrale extracellulare con un conseguente aumento della fluorescenza a puncta che corrispondono a vescicole / terminali presinaptici. Vibrodissociation dei neuroni dell'ippocampo di topo spH21 permette la visualizzazione di puncta fluorescenti delle dimensioni e della posizione prevista per i terminali GABAergici (Figura 8A). L'applicazione delle high-K + – contenente soluzione esterna aumenta la fluorescenza in questi terminali, e questo effetto è bloccata in presenza di una soluzione esterna in cui è ridotto il calcio extracellulare a 0,2 mm (Figura 8B). Così, la depolarizzazione indotta aumento della fluorescenza sembra riflettere accoppiamento eccitazione-secrezione a livello delle sinapsi dei neuroni GABAergici nella preparazione-Bouton. La capacità di misurare transienti di calcio presinaptico e la fusione delle vescicole nei terminali degli assoni del neurone-bouton preparazione ci permette di esaminare gli effetti di neuromodulatori, farmaci d'abuso e sui meccanismi di plasticità sinaptica presinaptici coinvolti nella secrezione di accoppiamento eccitazione-esocitosi e / endocitosi. Queste tecniche possono anche essere combinato con altri strumenti molecolari e geneticamente topi per esaminare il ruolo delle proteine ​​particolare nella funzione presinaptica e la modulazione / plasticità. Figura 1. Vibrodissociated neuroni della regione CA1 dell'ippocampo (A) Fusione di immagine DIC uno° verde immagini di fluorescenza da un mouse GAD65. Immagine DIC è fusa per mostrare chiaramente le posizioni dei terminali verde (B) da una immagine a fluorescenza (spH21) topo synaptophluorin. Barra di scala = 10 micron Figura 2 di calcio su indicatori procedura di caricamento: (A) cellula intera è caricata con AM-esterificati colorante; (B) a cellula intera registrazione diluisce colorante; (C) i terminali sono visualizzati come regioni di interesse (punte di freccia).. Figura 3. Schema del setup sperimentale per il controllo simultaneo a cellula intera registrazione e immagini di calcio in terminali presinaptici in neuroni vibrodissociated. EMCCD = carica dell'elettrone moltiplicando dispositivo ad accoppiamento. Figura 4. Rappresentante mostrando forme d'onda (A) potenziali d'azione spontanei da un neurone vibrodissociated CA1 e (B) le risposte potenziale di membrana a iperpolarizzante e depolarizzanti iniezioni di corrente in corrente-clamp registrazioni da un neurone CA1. Figura 5. (A) Rappresentante di forme d'onda iPSCs spontanea da un neurone piramidale CA1. (BC) La iPSCs sono stati bloccati da entrambe le gabazine (10 mM; B) o bicucullina (20 mM; C). Figura 6. TTX inibisce spontanea la trasmissione sinaptica GABAergici, ed elimina i transitori di calcio presinaptico nella preparazione vibrodissociated dell'ippocampo. (A) Registrazione da un neurone vibrodissociated prima e durante l'applicazione TTX. Si noti la diminuzione della frequenza e l'ampiezza di sIPSCs. (B) transienti di calcio osservata in un Fluo-4-terminale presinaptico caricato su un neurone vibrodissociated prima e durante l'applicazione TTX. Si noti la perdita completa dei transitori. Figura 7. Simultanea di immagini indicatore di calcio e sIPSC a cellula intera registrazione che mostra gli effetti di alta K + stimolazione. (A) Fluorescenza misurati nel tempo da un bouton presinaptico caricato con Fluo-4:00 colorante. (B) contestuale aumento della frequenza e ampiezza sIPSC durante l'alta applicazione K +. Figura 8. Ca 2 +-dipendente ad alta K + risposta boutons presinaptico di spH21 neuroni piramidali della regione CA1 dell'ippocampo. (A) immagine di fluorescenza di un neurone vibrodissociated. (B) High-K applicazione + (indicato dalla barra nera) ha determinato un aumento sostenuto della fluorescenza in presenza del nostro normale extracellulare di Ca 2 +, che contiene la soluzione (2 mM Ca 2 +). Nessun aumento è stato osservato fluorescenza a basso extracellulare di Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +). I dati nel grafico sono stati normalizzati per pre-high-k + i livelli di fluorescenza, e mostrano medio di risposta da 3 boutons.