シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

1。炎シールガラスのマイクロピペットの準備微小電極のガラスを使用して、フレーミング、ブラウンまたは同等のマイクロピペットプラー（先端直径約2ミクロン）を標準のパッチクランプピペットを引き出します。 200から300ミクロンの直径を持つ溶融ボール形になるまで〜2秒のためのブンゼンバーナーから炎への場所のマイクロピペットの先端。 急速に圧電バイモルフ、リレー、または同等に効果的なデバイスを使用して（走行距離100から200μm）を横方向に振動することができるマイクロマニピュレータ上にホルダーの上に場所は火炎密封パッチピペット。 2。 P1 – P21ラットまたはマウスの脳スライスを準備 124のNaCl、4.5 KClを、1.2のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、および10 D -グルコース：以下の組成（mMで）で人工脳脊髄液（ACSF）を準備する。 〜15分間95％酸素/ 5％CO 2ガスによる気泡のソリューションは、その後、2mMのCaCl 2及び1mMのMgCl 2を加える。 脳切片を切断： ハロタンやイソフルランで動物を麻酔。動物を刎ねる – 脳を削除 – 所望の配向（等、冠状、矢状、横）のブロックの脳を関心領域を含むように。 接辞はACSFに浸した振動脳スライサーの段階にブロックされた脳 – 250から400μmの厚さで、セクションの脳 – ACSFの場所のスライスは、流体/すべての表面上のガスの曝露を可能にするネット上の"プレインキュベーション"チャンバー内carbogenでバブリング – スライスは、少なくとも1時間この培地中で平衡化することができます。 3。 Vibrodissociation とNaOHを用いて150のNaCl、5のKCl、10 HEPES、1のMgCl 2、2.5のCaCl 2、10 7.4に設定されたpHを有するD -グルコース：以下の組成（mM）でのHEPES緩衝生理食塩水で35 mm径の培養皿を埋める浸透圧は、ショ糖を使用して〜300 mOsMに調整。培養皿には皿の底に強力な細胞接着の必要性に応じて、例えば、ポリ- L -リジンで被覆されたサスペンションの皿、標準細胞培養皿、ガラスのカバースリップの挿入と培養皿、または料理があります。 培養皿にスライスを置き、250 xで解剖ステレオスコープと可視化重量として動作するようにスライスの上面に配置曲がった白金線を（直径0.5mm）を使用して底にスライスを保持する。 希望する脳の領域におけるスライス面上の火炎密封されたマイクロピペットの先端を合わせます。遠足の距離〜100μm程度で、10〜30 Hzで横方向に先端を振動させるマイクロマニピュレータをアクティブにします。マイクロマニピュレータを使用して、それは〜30秒内でスライス全体を通るようにスライスの組織に深く先端を移動します。特定の脳領域から得られる単離したニューロンの数を最大化するために、必要に応じてこの手順を繰り返します。 鉗子でスライスをピックアップし、ゆっくりと溶液中ではまだながら、それを横に振る – – その後、完全にスライスを削除し、破棄スライスからヒントを削除します。 解離細胞が少なくとも10分間シャーレの底に沈降し、遵守することができます。 4。電気生理学的記録倒立顕微鏡のステージ上のニューロンを含んでいる皿を置き、63 ×対物レンズに10 ×と視覚化する。円滑な特許膜、無ブレブ形成、および検出可能ですが、大型ではない核の神経細胞を探します。位相コントラスト光学系が使用されている場合は、あまりにも青ではない、黄がかった相明るいニューロンを探します。目的の塩、栄養素、受容体拮抗薬を含む細胞外液で表面かん流する細胞は、等（当社の標準は、上記のHEPES緩衝生理食塩水である（3.1節））、多くの場合、5μMの2,3 – ジオキソ-6 – ニトロ- 1、を補足2,3,4 – テトラヒドロベンゾ[F]キノキサリン-7 – スルホンアミド二ナトリウム（NBQX）、および高速なGABAの分離を可能にするイオンチャネル型グルタミン酸受容体をブロックするために25から100μMD – 2 – アミノ-5 – phosphonopentanoic酸（AP5）受容体を介した性IPSC 1,2。 フレーミング – ブラウンまたは同等のプーラーを使用して標準的なパッチのマイクロピペットを引き出します。 -ベースのソリューション-ピペットチップ抵抗は、ClでいっぱいMΩ2-4（標的細胞のサイズに応じて）でなければなりません。 標準的な電気生理学的手法を用いて可視化ニューロンからホールセル記録を確立する。 ギャップのないデータ収集プロトコルを使用して自発性シナプス後電流（sPSCs）を記録。 0.2から1μMのテトロドトキシンおよび/ ​​または低Ca 2 +を適用する-ミニチュア性シナプス後電流（mPSCs）を記録するために細胞外溶液を含む。 ソリューションおよび薬理学的作用物質を直接細胞に適用することができます。我々は、ステッピングモータ駆動マニピュレータに取り付けられたチューブの横方向の移動を伴うソリューションの交換との融合正方形の先端がガラス管からローカル灌流を使用してください。このアロ細胞外分子の含有量の急激な変化、受容体アゴニストの応用、等を達成するためにミリ秒の100〜10秒で解決策の交換のためにあった赤池らは、単一のシナプス前boutons 3,4を刺激する技術を開発しました。マイクロピペットは、可視化ブートンと刺激の近くに配置されます（5-10μAの負の刺激電流を、0.1から0.2ミリ秒持続時間）が与えられます。ユニタリ性IPSCが記録され、そしてそのような失敗の方法などのメソッドは、シナプス前及びシナプス後機能の変化を調べるために使用することができます。 5。イメージングシナプス前終末シナプス後ニューロンは、パッチピペットを介して各種の染料を充填することができる。神経細胞はまた、選択された細胞集団における緑色蛍光タンパク質（GFP）などの蛍光蛋白質（fps）を発現するマウスから作製することができる。 シナプス前終末には、特定の介在ニューロンの集団でFPSを表現したマウスから作られたvibrodissociatedニューロンで可視化することができる。例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD65）プロモーターによって駆動されるGFPを発現するマウスは、海馬バスケット細胞および他の介在ニューロンにおける緑のsomaの複数形とプロセスを示しています。海馬CA1領域からVibrodissociated錐体細胞は、彼らのsomaの複数形と近位樹状突起（図1A）に並列したGFP陽性軸索終末を持っている。エクスプレスsynaptopHlourinは（pH感受性GFP変異体は、シナプス小胞関連VAMP2タンパク質に融合された）THY1プロモーターの制御下でもpH感受性蛍光（図1B）を示すFP陽性添付boutonsを持っていることをマウスからvibrodissociated錐体細胞。 シナプス前boutonsは、AM -エステル化合物5を用いてカルシウム指示薬染料と他の蛍光分子で読み込むことができます。図2は、カルシウムインジケーター色素Fluo4 – AMを使用してロードの例を示します。最初に、1〜2μmAM -エステル色素が10分間37℃での神経細胞に適用されます。染料は無料、細胞非透過性と消されていない染料をもたらす、分子開裂をエステラーゼ細胞内環境、中に侵入することができます。このアプローチは、両方の前とシナプス後細胞の要素を読み込みます。ローディング後、細胞をHEPES緩衝生理食塩水で洗浄し、さらに10分間37℃に保った。ガラスピペット電極とGΩシールを行う前に、細胞は外部の緩衝液で3回洗浄されています。 全細胞記録は、その後、染料を含まない細胞内液を用いて確立されます。録音の2〜5分間後に、色素は主にみたFluo – 4 -ロードされたシナプスboutonsの可視化を可能にする、シナプス後ニューロンから削除されます。この手法は、Yeら5によって開拓された。 色素負荷boutonsは、どちらのカメラベースや多光子顕微鏡で高倍率、高開口数の対物レンズを用いて可視化することができる。同時ホールセル記録し、カルシウムイメージングを図3に示すように、セットアップを使用して達成することができます。図2Cに示すように、ニューロンとboutonsの画像は、電荷結合素子（EMCCD）カメラを乗じて電子を捕獲した。励起用光源の消費電力は12％の出力に調整ニュートラル濃度1.0フィルタとアイリスフィルタと1.2％に減弱した。緑のシナプス前boutonsからのカルシウムの過渡電流が観察され、リアルタイムで記録、およびオフラインで測定することができます。 6。代表的な結果： Vibrodissociatedニューロンの自発及び電流注入誘発射撃典型的なvibrodissociated海馬のCA1錐体ニューロンからの記録は、図4Aに示されています。自発的なオーバーシュートの活動電位は、ラット基底外側扁桃体、海馬とVTA 1,5から解離錐体ニューロンで観察することができます。十分な大きさの分極電流は強い電流注入に対する応答の中程度の電流レベルと非収容活動電位を持つ典型的な遅延発火パターンとオーバーシュートの活動電位を誘発しながら、電流注入を過分極CA1錐体細胞からの中に、現在のクランプ記録は、（典型的な電圧の応答を生成する図4B）。 Vibrodissociatedニューロンにおける自発的とミニチュアGABA作動性抑制性シナプス後電流塩化セシウムベースの細胞内液との電圧クランプ記録中に、自発的なシナプス電流（図5A）が観察されています。これらのイベントは、低カルシウム含有溶液2,6で除去され、そしてほとんどの神経細胞の種類に完全にGABAなどビククリンやgabazine（図5B、C）のような受容体拮抗薬は、これらのGABA放出と活性化により媒介sIPSCsであることを示すことによって、ブロックされるこのイオンチャネル型受容体サブタイプの。しかし、このような基底外側扁桃体2と腹側被蓋野5,7、GABA受容体遮断などの脳領域からの主ニューロンにおけるAMPA型受容体のグルタミン酸作動性活性化により媒介される期間が短いのEPSCsを明らかにする。興味深いことに、ほとんどの毒素感受性の電位依存性ナトリウムチャネルの遮断に特異的な濃度でTTXのアプリケーションは、いくつかの脳領域（図6A）2,4,7からvibrodissociatedニューロンで観察sIPSCsの周波数と振幅を低減します。このように、ナトリウムチャネル活性は、ピンチオフシナプスboutonsでGABA放出に参加しています。本格的なナトリウムの活動電位は、これらの端子に発生した場合、それはまだ明らかではない。それはしっかりと密封されて1μMの直径の軸索端子の入力抵抗がよくGΩ範囲内である可能性が高いことは注目に値します。このように、ナトリウムチャネルの小さな数からオープンにすることによって、励起分泌カップリングを媒介するカルシウムチャネルを活性化するための端子を脱分極するのに十分かもしれません。これらのカルシウムチャネルをテーマに、証拠は、NとP / Q型チャネルは海馬CA1および他の8からvibrodissociated製剤におけるGABA作動端子でのリリースに参加することを示唆している。 神経伝達物質と受容体の数によって変調し、伝送の可塑性はvibrodissociatedニューロンの3,4,9を使用して検討されている。そのような調節作用を有することが示されて神経伝達物質は、アデノシン、GABA、セロトニン、内在性カンナビノイド、など2,6,10,11,12です。さらに、そのような抑制（DSI）の内因性カンナビノイド依存脱分極による抑制などの短期シナプス可塑性は、またこの準備2,11に記載されている。これらの知見は、内因性の神経修飾物質による受容体を介したおよびtrans -シナプス伝達の多くの形態がvibrodissociated準備で無傷であることを示している。 Vibrodissociated準備中のカルシウムトランジェントと軸索終末の小胞リリース上記の記述EMCCD装備倒立顕微鏡を使用して、我々はvibrodissociatedニューロン-ブートンの準備にシナプス前終末のカルシウムトランジェントを検討した。図2は、海馬のCA1錐体ニューロンにおけるAM -エステルであるFluo – 4およびその後のシナプス後色素希釈を持つセルの負荷を示しています。自発的カルシウムトランジェントは、図6Bに関心の領域（ROI）として示されているいくつかの色素で満たされたboutonsで観察される。 1μMのテトロドトキシン（TTX）のアプリケーションは、それらがその後のカルシウムの上昇につながる、自発的にboutonsで活性化される電位依存性ナトリウム電流の活性化によって媒介されていることを示す、これらの自発的なトランジェントを除去します。シナプス前終末（図7A）に対応するROIをで測定されるように、高速溶液交換して40mMのに10mMから外KClを大きくすると、蛍光増生成します。シナプス後ニューロンから同時記録はsIPSCsを監視し、イベントの頻度が高K +脱分極（図7B）増加しているかどうかを確認するために使用されます。 我々はsynaptopHlourinがTHY1プロモーターの制御下に構築発現するマウスを使用しているシナプス前boutonsにおける小胞融合を視覚化へ（spH21マウスのラベル）。黄道pHlourin（拡張されたpH感受性を持つGFP変異体）12を膜タンパク質（VAMP2）13に関連する小胞にリンクされている分子構造のSynaptopHluorin。この構成は、比較的酸性の環境では蛍光消光する小胞の内腔にpHlourinモチーフをsituates。小胞融合時に、このモチーフは、小胞/シナプス前終末に対応していることに涙点における蛍光の結果がより高く、より中立的な細胞外環境にさらされている。 spH21マウスから海馬ニューロンのVibrodissociationは、GABA作動性の端末（図8A）のために予想されるサイズと位置の蛍光涙点の可視化が可能になります。これらの端子の蛍光外液の増加を含む、そしてこの効果は細胞外カルシウムが0.2mm（図8B）に還元される外部溶液の存在下でブロックされている-高K ​​+のアプリケーション。従って、蛍光の脱分極誘発性の増加はニューロン-ブートンの準備のGABA作動性シナプスで興奮分泌連関を反映するように表示されます。 ニューロン – 神経繊維末端の準備の軸索末端にシナプス前カルシウムトランジェントと小胞融合を測定する能力は、私たちは興奮分泌連関とエキソサイトーシス/エンドサイトーシスに関与するシナプスメカニズムの虐待とシナプス可塑性の神経修飾物質、薬剤の効果を調べることができます。これらの技術はまた、シナプス前機能とモジュレーション/可塑性における特定のタンパク質の役割を調べるために他の分子ツールと遺伝子改変マウスと組み合わせることができます。 図1海馬CA1領域からVibrodissociatedニューロン（）DICの合併のイメージGAD65マウスからND緑色蛍光画像。 DIC画像は明らかにsynaptophluorin（spH21）マウスから（B）蛍光画像の緑の端子の場所を表示するためにマージされます。バー=10μmのスケール 図2カルシウムインジケーターローディングの手順：（A）全細胞がAM -エステル色素がロードされている、（B）ホールセル記録では、色素希釈、（C）端子は、関心領域（矢印）として可視化する。。 図3。vibrodissociatedニューロンのシナプス前終末における同時ホールセル記録し、カルシウムイメージングのための実験セットアップの模式図。 EMCCD =電子は、電荷結合素子を乗じて。 vibrodissociated CA1ニューロンから（）自発的な活動電位と（B）膜電位応答がCA1のニューロンからの電流クランプ記録で、現在の注射を過分極と脱分極することを示す4。代表波形図 。 図5（）CA1錐体ニューロンからの自発性IPSCの代表波形。またはビククリン（20μM、C）、（BC）性IPSCはgabazine（B 10μM）のどちらかによってブロックされました。 図6。TTXは、自発的なGABA作動性シナプス伝達を阻害し、vibrodissociated海馬準備にシナプス前カルシウムトランジェントを除去します。 TTXのアプリケーションの実行前および実行中に、vibrodissociatedニューロンから（A）録音。周波数とsIPSCsの振幅の減少に注意してください。 （B）TTXのアプリケーションの実行前および実行中に、vibrodissociatedニューロンにみたFluo – 4 -ロードされたシナプス前終末で観測されたカルシウムトランジェントを。トランジェントの完全な損失に注意してください。 図7。同時カルシウム指示薬のイメージングと高K +刺激の効果を示すsIPSCホールセル記録。 （A）蛍光はみたFluo – 4AMの染料でロードされたシナプス前神経繊維末端から経時的に測定。 （B）、高K +アプリケーション中のsIPSC周波数と振幅の同時増加を。 図8。Ca 2 +依存性の高K +応答海馬CA1領域からspH21錐体ニューロンのシナプス前boutonsインチvibrodissociatedニューロンの（A）蛍光画像。 （B）、高K +アプリケーション（黒のバーで示される）私たちの通常の細胞外Ca 2 +含有溶液（2 mMのCa 2 +の ）の存在下で蛍光の持続的な増加をもたらした。は蛍光の増加は、低細胞外Ca 2 +（0.2mMのCa 2 +）の時に観察されなかった。グラフ内のデータは、事前に高K +蛍光レベルに正規化、および3 boutonsから平均的な応答を示していた。