Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

1. Preparación de la llama-de vidrio selladas Micropipeta El uso de vidrio de microelectrodos, tirar de un estándar de patch-clamp en una micropipeta Flaming-Brown o su equivalente extractor micropipeta (diámetro de la punta ~ 2 mm). Micropipeta Coloque la punta en la llama de un mechero de Bunsen de ~ 2 segundos hasta que se forme bola fundida con un diámetro de 200-300 micras. Coloque al fuego sellado parche pipeta en el soporte de un micromanipulador que pueden ser rápidamente vibrar de lado a lado (distancia de viaje 100-200 micras) usando un transductor piezoeléctrico bimorfo, relé o dispositivo equivalente efectiva. 2. Preparación de secciones de cerebro de P1-P21 ratas o ratones Prepare líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) con la siguiente composición (en mM): NaCl 124, KCl 4.5, 1.2 NaH 2 PO 4, 26 de NaHCO 3, y 10 D-glucosa. Solución de la burbuja con oxígeno al 95% / 5% de gas CO 2 de unos 15 minutos, luego agregar 2 mM CaCl 2 y 1 mM de MgCl 2. Cortar rodajas de cerebro: Anestesiar a los animales con halotano o isoflurano. Decapitar a los animales – eliminar del cerebro – cerebro de bloques en la orientación deseada (coronal, transversal parasagital, etc) para incluir a las regiones de interés. Fije el cerebro bloqueado a la etapa de una máquina de cortar el cerebro vibrando sumergido en LCRa – sección del cerebro con un espesor de 250-400 micras – Coloque las rebanadas en ACSF burbujas con carbogen en un "preincubación" cámara en red que permite el líquido / gas de exposición en todas las superficies – permitir que las rebanadas se equilibre en este medio por lo menos durante una hora. 3. Vibrodissociation Llene un 35 mm de diámetro placa de cultivo con HEPES solución salina tamponada con la siguiente composición (mM): NaCl 150, KCl 5, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 D-glucosa con pH ajustado a 7,4 con NaOH y osmolaridad ajustada a alrededor de 300 mOsm con sacarosa. Placas de cultivo pueden ser platos de suspensión, placas de cultivo celular estándar, placas de cultivo con inserciones de cubreobjetos, o platos recubiertos con, por ejemplo, poli-L-lisina, en función de la necesidad de una mayor adherencia de las células de la parte inferior plato. Coloque el trozo en el plato de la cultura y visualizar con un estereoscopio de disección a 250 x. Mantenga rebanada de la parte inferior con un alambre de platino doblado (0,5 mm de diámetro) colocados en la superficie superior del sector para actuar como un peso. Coloque la punta de la micropipeta llama sellada en la superficie de corte en la región del cerebro que desee. Activar micromanipulador para vibrar la punta lateralmente a 10-30 Hz, con una distancia de excursión de aproximadamente 100 micras. Utilizando el micromanipulador, mover la punta más profundo en el tejido de corte de tal forma que pasa a través de la rebanada completa en aproximadamente 30 segundos. Repita este paso según sea necesario para maximizar el número de neuronas aisladas puede obtener de una región cerebral determinada. Retire la punta de la corte – levantar el corte con una pinza y agitarlo mientras que todavía en la solución – a continuación, retire completamente corte y deseche. Permitir que las células disociadas se asiente y se adhieren a la parte inferior plato por lo menos 10 min. 4. Registro electrofisiológico Coloque el plato de las neuronas que contienen en el escenario de un microscopio invertido y visualizar con 10 x 63 x objetivo. Busque las neuronas con una membrana lisa de patentes, vesiculación no, y un núcleo de gran tamaño detectable, pero no. Si la óptica de contraste de fase se utilizan, mira para la eliminación brillantes neuronas con un tinte amarillento, no muy azul. Superfuse células con una solución extracelular que contienen sales deseada, los nutrientes, antagonistas de los receptores, etc (nuestro estándar es la solución salina de buffer HEPES mencionado anteriormente (punto 3.1)), a menudo se completa con 5 M 2,3-dioxo-6-nitro-1, 2,3,4-tetrahydrobenzo [f] quinoxalina-7-sulfonamida M de sodio (NBQX), 25-100 y D-2-amino-5-phosphonopentanoic ácido (AP5) para bloquear los receptores ionotrópicos de glutamato, que permite el aislamiento de rápido GABA A IPSCs mediados por receptores 1,2. Tire de una micropipeta parche estándar con un extractor de Flaming-Brown o su equivalente. Pipeta de resistencia a la punta debe ser 2.4 mW (dependiendo del tamaño de las células diana) cuando se llena con un Cl – – ​​solución basada en. Establecer un registro de células enteras de una neurona visualizado utilizando técnicas electrofisiológicas. Registro de las corrientes postsinápticas espontáneas (sPSCs) con un hueco libre del protocolo de adquisición de datos. Aplicar 0.2-1 tetrodotoxina M y / o de bajo Ca 2 + – que contiene la solución extracelular para registrar las corrientes postsinápticas miniatura (mPSCs). Soluciones y agentes farmacológicos pueden ser aplicados directamente a las células. Usamos superfusión local de tubos de vidrio fundido de punta cuadrada con el intercambio de una solución para asegurar el movimiento lateral de los tubos montados en un micromanipulador paso a paso-con motor. Esta asignaciónfue para el intercambio de solución de 10s a 100s de ms para alcanzar los rápidos cambios en el contenido molecular extracelular, la aplicación de agonistas de los receptores, etc Akaike y sus colegas han desarrollado técnicas para estimular la única boutons presináptica 3,4. Una micropipeta se coloca cerca de una bouton visualizar y estimulación se da (corrientes negativas de estímulo de 5-10 mA, 0.1-0.2 ms de duración). IPSCs unitaria se registran, y de métodos como el método de las fallas se pueden utilizar para examinar los cambios en la función presináptica y postsináptica. 5. Imágenes de terminales presinápticas Neuronas postsinápticas se puede llenar con varios tintes a través del parche pipeta. Las neuronas también se puede hacer de ratones que expresan proteínas fluorescentes (PM) como la proteína verde fluorescente (GFP) en determinadas poblaciones celulares. Terminales presinápticos pueden ser visualizados en las neuronas vibrodissociated a partir de ratones que expresan FP en las poblaciones de interneuronas en particular. Por ejemplo, los ratones que expresan GFP impulsado por la glutamato decarboxilasa 65 (GAD65) somata promotor en verde y los procesos en las células del hipocampo y la canasta de las interneuronas otros. Vibrodissociated las neuronas piramidales de la región CA1 del hipocampo tienen GFP-positivas terminales de los axones adosados ​​a sus cuerpos celulares y dendritas proximales (fig. 1A). Las neuronas piramidales vibrodissociated de ratones que expresan synaptopHlourin (un pH-sensibles mutantes GFP fusionada a la vesícula sináptica asociada VAMP2 proteína) bajo el control del promotor Thy1 también boutons FP-positivo adjunto que muestran fluorescencia sensible al pH (fig. 1B). Boutons presináptica se puede cargar con tintes indicador de calcio y otras moléculas fluorescentes con AM-esterificados compuestos 5. La figura 2 muestra un ejemplo de carga con el tinte de calcio indicador Fluo4-AM. En primer lugar, M 01.02 AM-esterificados tinte se aplica a las neuronas a 37 º C durante 10 min. Tinte puede penetrar en el medio intracelular, donde se unirá esterasas la molécula, dando tintes libres de células impermeable y insaciable. Este método de las cargas, tanto los elementos celulares pre-y post-sinápticas. Tras la carga, las células se lavan con HEPES solución salina tamponada y se mantiene a 37 º durante 10 min. Antes de tomar una GΩ a sellar con un electrodo de pipeta de vidrio, las células se lavan 3 veces con solución buffer externo. Una grabación de células enteras se establece entonces con una solución intracelular libre de tinte. Después de 2-5 minutos de grabación, el colorante es principalmente eliminado de la neurona postsináptica, permitiendo la visualización de Fluo-4-cargado botones sinápticos. Esta técnica fue desarrollada por Ye et al 5. El boutons tinte a cargar y se pueden visualizar mediante un gran aumento, el objetivo de alta apertura numérica, ya sea con un microscopio basado en cámaras o multifotónica. Simultánea de células enteras de grabación y de imágenes de calcio se puede lograr utilizando una configuración como se muestra en la Figura 3. Las imágenes de la neurona y boutons se muestra en la Figura 2C fueron capturados con un electrón dispositivo multiplicador de carga acoplada (EMCCD) de la cámara. El poder de la fuente de luz para la excitación se atenuó a 1,2%, con un filtro de densidad neutra 1,0 y un filtro de iris ajustado al 12% de salida. Transitorios de calcio de los boutons presináptica verde se pueden observar y grabar en tiempo real, y se mide en línea. 6. Los resultados representativos: Inyección evocados espontánea y actual descarga de las neuronas Vibrodissociated Grabaciones de una típica vibrodissociated neurona del hipocampo CA1 piramidal se muestran en la Figura 4. Espontáneas de potenciales de acción rebasamiento se puede observar en las neuronas piramidales disociada de la rata basolateral amígdala, el hipocampo y VTA 1,5. Durante la actual-clamp grabaciones de las neuronas piramidales CA1, hiperpolarización de inyección de corriente produce respuestas típicas de tensión, mientras que las corrientes de despolarización de magnitud suficiente obtener potenciales rebasamiento de acción con el típico patrón de activación retardada con moderados niveles actuales y no acomodar los potenciales de acción en respuesta a la fuerte inyección de corriente ( Figura 4B). Espontánea y en miniatura Corrientes postsináptico inhibidor GABA en neuronas Vibrodissociated Durante las grabaciones de fijación de voltaje con una solución basada en CsCl intracelular y espontánea de las corrientes sinápticas se observa (Figura 5). Estos eventos se eliminan en la baja de calcio que contiene la solución 2,6, y en la mayoría de tipos neuronales están completamente bloqueados por antagonistas de los receptores GABA A como bicuculina o gabazine (Figura 5 B, C), lo que indica que se trata de sIPSCs mediado por la liberación de GABA y la activación de este subtipo de receptor ionotrópicos. Sin embargo, en las neuronas principales de las regiones del cerebro como la amígdala basolateral 2 y el área tegmental ventral 5,7, un bloqueo de los receptores GABArevela más corta duración EPSCs mediada por la activación de los receptores glutamatérgicos tipo AMPA. Curiosamente, la aplicación de TTX en concentraciones que son específicos para el bloqueo de la mayoría de la toxina sensibles a los canales de sodio dependientes de voltaje se reduce la frecuencia y la amplitud de la sIPSCs observado en las neuronas vibrodissociated de varias regiones del cerebro (Figura 6) 2,4,7. Así, la actividad del canal de sodio participa en la liberación de GABA en el apretado botones sinápticos-off. Aún no está claro si en toda regla potenciales de acción de sodio se producen en estos terminales. Vale la pena señalar que la resistencia de entrada de un pozo sellado una terminal de M axón diámetro es probable que sea así en el rango GΩ. Por lo tanto, la apertura de incluso un pequeño número de canales de sodio podría ser suficiente para despolarizar terminales para activar los canales de calcio que median la secreción de acoplamiento de la excitación. Sobre el tema de estos canales de calcio, la evidencia sugiere que el N y P / Q-tipo de canales de participar en la liberación en las terminales GABAérgicas en los preparativos de vibrodissociated CA1 del hipocampo y en otras 8. La modulación y la plasticidad de la transmisión de una serie de neurotransmisores y receptores ha sido examinado con las neuronas vibrodissociated 3,4,9. Los neurotransmisores han demostrado que tales acciones moduladoras son la adenosina, los inhibidores GABA, los endocannabinoides, etc 2,6,10,11,12. Además, a corto plazo plasticidad sináptica, como cannabinoide endógeno dependiente de la despolarización inducida por la supresión de la inhibición (DSI) también se ha descrito en esta preparación 2,11. Estos resultados indican que muchas formas de mediada por los receptores y la señalización trans-sináptica por neuromoduladores endógenos están intactos en la preparación vibrodissociated. Los transitorios de calcio y liberación vesicular en terminales de los axones en la preparación Vibrodissociated Usando el microscopio invertido equipado EMCCD describen más arriba, hemos examinado los transitorios de calcio en las terminales presinápticas de neuronas en el vibrodissociated-Bouton preparación. La figura 2 muestra la carga de células con AM-esterificados dilución de colorante Fluo-4 y posterior post-sináptica del hipocampo en las neuronas piramidales CA1. Transitorios espontánea de calcio se observan en algunos boutons tinte lleno de muestra como las regiones de interés (ROI) en la Figura 6B. Aplicación de la tetrodotoxina M 1 (TTX) elimina estos transitorios espontánea, lo que indica que están mediadas por la activación de las corrientes de sodio dependientes de voltaje que se activa de forma espontánea en boutons, lo que aumenta el calcio posteriores. El aumento de KCl extracelular de 10 mm a 40 mm con cambio de solución rápida produce un aumento de fluorescencia como se mide en rendimiento de la inversión que corresponden a los terminales presinápticos (Figura 7). Grabación simultánea de la neurona postsináptica se utiliza para controlar sIPSCs y determinar si la frecuencia de eventos se incrementa en un alto K + despolarización (Figura 7). Para visualizar la fusión de vesículas en la boutons presináptica hemos utilizado ratones que expresan el synaptopHlourin construir bajo el control del promotor Thy1 (con la etiqueta spH21 ratones). SynaptopHluorin en una construcción molecular en el que la eclíptica pHlourin (un mutante GFP con mayor sensibilidad al pH) 12 está relacionada con la proteína asociada a la membrana de vesículas (VAMP2) 13. Este acuerdo sitúa el motivo pHlourin en el lumen de vesículas en el medio ambiente relativamente ácido apaga la fluorescencia. Tras la fusión de vesículas este motivo se expone al medio extracelular más neutral con el consiguiente aumento de la fluorescencia en puntos lagrimales que corresponden a vesículas / terminales presinápticos. Vibrodissociation de las neuronas del hipocampo de ratones spH21 permite la visualización de los puntos lagrimales fluorescente del tamaño y la ubicación prevista para terminales GABAérgicas (Figura 8A). Aplicación de la alta-K + – que contiene la solución externa aumenta la fluorescencia en estos terminales, y este efecto es bloqueado en la presencia de una solución externa en la que se reduce el calcio extracelular a 0,2 mM (Figura 8B). Por lo tanto, el aumento de la despolarización de la fluorescencia inducida parece reflejar la excitación-secreción de acoplamiento en las sinapsis GABAérgicas en la preparación de las neuronas-Bouton. La capacidad de medir los transitorios de calcio presinápticos y la fusión de vesículas en las terminales de los axones de las neuronas de la preparación-Bouton nos permite examinar los efectos de los neuromoduladores, el abuso de drogas y la plasticidad sináptica en los mecanismos presinápticos que participan en el acoplamiento excitación-secreción y la exocitosis / endocitosis. Estas técnicas también se pueden combinar con otras herramientas moleculares y los ratones genéticamente modificados para examinar el papel de determinadas proteínas en función de pre-sináptica y la modulación / plasticidad. Figura 1. Vibrodissociated neuronas de la región CA1 del hipocampo (A) la imagen fusionada de la CID unaª fluorescencia verde imágenes de un ratón GAD65. DIC se fusiona la imagen para mostrar con claridad la ubicación de los terminales de color verde (B) Imagen de fluorescencia de una synaptophluorin (spH21) del ratón. Barra de escala = 10 m Figura 2 Calcio indicador de carga de procedimiento: (A) de células enteras se carga con AM-esterificados tinte; (B) de células enteras de grabación diluye tinte; (C) terminales son visualizados como regiones de interés (puntas de flecha).. Figura 3. Esquema del montaje experimental para uso simultáneo de células enteras de grabación y de imágenes de calcio en las terminales presinápticas de las neuronas vibrodissociated. EMCCD = carga del electrón multiplicando dispositivo de acoplamiento. Figura 4. Representante mostrar formas de onda (A) los potenciales de acción espontánea de un vibrodissociated neurona CA1 y (B) las respuestas de la membrana de tensión de hiperpolarización y despolarización inyecciones de corriente en las grabaciones actuales-clamp de una neurona CA1. Figura 5. (A) Representante de formas de onda IPSCs espontánea de una neurona piramidal CA1. (BC) La IPSCs fueron bloqueadas por cualquiera de las gabazine (10 M, B) o bicuculina (20 M, C). Figura 6. TTX inhibe la transmisión sináptica espontánea GABAérgicas, y elimina las oscilaciones de calcio presinápticos en la preparación del hipocampo vibrodissociated. (A) de grabación de una neurona vibrodissociated antes y durante la aplicación de TTX. Tenga en cuenta la disminución de la frecuencia y la amplitud de sIPSCs. (B) los transitorios de calcio observados en una terminal presináptica Fluo-4-cargados en una neurona vibrodissociated antes y durante la aplicación de TTX. Tenga en cuenta la pérdida total de los transitorios. Figura 7. Imágenes simultáneas indicador de calcio y sIPSC de células enteras de grabación que muestra los efectos de la estimulación de alto K +. (A) de fluorescencia medido a través del tiempo a partir de una bouton presináptica cargados con Fluo-4 a.m. tinte. (B) el aumento simultáneo de la frecuencia y amplitud durante sIPSC alto K + aplicación. Figura 8. Ca 2 +-dependiente de alto K + en la respuesta boutons presináptica de las neuronas piramidales spH21 de la región CA1 del hipocampo. (A) Imagen de fluorescencia de una neurona vibrodissociated. (B) de alto K + aplicación (indicado por barra de color negro) resultó en un incremento sostenido de la fluorescencia en presencia de nuestros normales Ca2 + extracelular que contiene la solución (2 mM Ca2 +). No hay un aumento de fluorescencia se observó en el bajo extracelular de Ca 2 + (0,2 mM Ca 2 +). Los datos del gráfico se normalizaron a pre-alta-K + niveles de fluorescencia, y que tengan una respuesta promedio de 3 boutons.