Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)
Summary
Virochip korunmuş dizi homoloji temelinde aynı anda, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman virüsler tespit etmek için tasarlanmış bir pan-viral mikroarray. İşte biz, varlığı bilinen ve bilinmeyen virüslere hem de klinik örnekleri analiz etmek için bir Virochip tahlil nasıl çalıştırılacağını göstermektedir.
Abstract
Virüslerin doğal dizisi çeşitliliği yanı sıra, geleneksel yöntemlerle algılanamaz SARS coronavirüs ve 2009 pandemik H1N1 influenza virüsü gibi roman viral patojenler, devam eden ortaya çıkması nedeniyle, pek çok bulaşıcı hastalıkların viral nedenlerin tanısı zordur. Bu zorlukları ele almak için, daha önce geliştirilmiş ve kapasitesi ile korunmuş sıra homoloji 1 dayanarak, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman varyantları tespit etmek için Virochip denilen bir pan-viral mikroarray platformu valide . Virochip kullanarak, tam spektrum, eşdeğer ya da geleneksel klinik test 2-5 üstün bir hassasiyet ile hastanede yatan hastalarda açıklanamayan kritik hastalık vakaları da dahil olmak üzere, solunum yolu enfeksiyonları ile ilişkili virüs tespit ettik. Virochip ayrıca, SARS coronavirüs 6,7, bir roman rinovirüs dalının 5, XMRV (prostat kanseri ile bağlantılı bir retrovirüs) 8, kuş bornavirus (papağanlar bir israf hastalığı nedeni) 9, dahil olmak üzere, yeni virüsleri tanımlamak için kullanılır olmuştur solunum ve ishal hastalık 10 ile çocuklarda ve yeni bir cardiovirus. Virochip güncel sürümü Agilent mikroarray platforma taşıdık ve ~ 36.000 probları Aralık 2009 itibariyle GenBank ~ üzerinde 1.500 virüslerden kaynaklanan oluşur. Burada örnek nükleik asit ekstraksiyon, rastgele primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu, floresan boya dahil, ve mikroarray hibridizasyon, tarama ve analiz de dahil olmak üzere, (~ 24 saat gerçekleştirme süresi) bitirmek için baştan bir Virochip testi işleme dahil adımları ortaya koymaktadır.
Protocol
Discussion
Virochip protokolü burada açıklandığı gibi karmaşık ve yetenekli ve titiz bir araştırma teknisyeni gerektirir. Doğru reaktif konsantrasyonu ve PCR etiketleme koşulları ve hibridizasyon kritik öneme sahiptir. Virochip protokolü nükleik asit ekstraksiyon TRIzol (Invitrogen) gibi bir doku çıkarma yönteminin kullanımı ile hastalıklı dokuların analizi kolayca uyum sağlamak için değiştirilebilir. Problar eklendi veya istenen spektrumu ve kapsamının genişliği elde etmek için gerekli silinmiş olabilir, örneğin "-the-fly", bakteri ve mantarlar gibi nonviral hedeflerin saptanması için yoklamaları dizayn edilebilir ve ekledi. Henüz geliştirme aşamasında Virochip testinin bazı uygulamalar, klinik laboratuvar, salgın araştırma, saflık taraması, ilaç ve aşılar ve yeni viral patojen keşif geniş spektrumlu bir viral teşhis içerir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Virochip protokolün ilk geliştirme ve optimizasyonu için David Wang, Anatoly Urisman Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, ve Alexander Greninger teşekkür ederim. Bu çalışma bir NIH K08 hibe ve Abbott Keşif Ödülü (CC) ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü (JLD) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
