באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים
Summary
Virochip הוא microarray הפאן ויראלי שנועד לזהות בו זמנית את כל וירוסים ידועים, כמו גם וירוסים רומן על בסיס הומולוגיה ברצף נשמרת. כאן אנו מדגימים איך לנהל assay Virochip לנתח דגימות קליניות עבור נוכחות של וירוסים מוכרים ושאינם מוכרים.
Abstract
האבחנה של גורם נגיפי מחלות זיהומיות רבות קשה בשל המגוון רצף הטבועה של וירוסים, כמו גם את הופעתם המתמשכת של פתוגנים נגיפיים הרומן, כמו הסארס קורונה ו – 2009 מגיפת נגיף שפעת H1N1, אשר אינו יכול לאתר את השיטות המסורתיות. כדי לטפל באתגרים אלה, פיתחנו בעבר ומאומתים פלטפורמה הפאן ויראלי microarray שנקרא Virochip עם היכולת לזהות את כל וירוסים ידועים, כמו גם גרסאות רומן על בסיס הומולוגיה ברצף משומר 1. שימוש Virochip, זיהינו את מלוא הספקטרום של וירוסים הקשורים זיהומים בדרכי הנשימה, כולל מקרים של מחלה קריטית מוסברת בחולים מאושפזים, עם רגישות שווה או עולה על 2-5 קונבנציונאלי ניסויים קליניים. Virochip שימש גם כדי לזהות וירוסים רומן, כולל קורונה הסארס 6,7, clade rhinovirus הרומן 5, XMRV (רטרווירוס קשור לסרטן הערמונית) 8, bornavirus העופות (הגורם ממחלה ממארת ב תוכים) 9, ו cardiovirus רומן בילדים עם מחלה נשימתית שלשולים 10. הגרסה הנוכחית של Virochip כבר ported כדי פלטפורמת Agilent microarray והוא מורכב ~ 36,000 בדיקות נגזר על ~ 1500 וירוסים GenBank בדצמבר 2009. כאן אנו מדגימים את השלבים המעורבים בעיבוד assay Virochip מתחילתו ועד סופו (~ זמן אספקה 24 שעות), כולל מיצוי מדגם חומצת גרעין, הגברה PCR בעזרת פריימרים אקראיים, שילוב צבע פלואורסצנטי, ואת ההכלאה microarray, סריקה וניתוח.
Protocol
Discussion
פרוטוקול Virochip כפי שתואר כאן הוא מורכב ודורש טכנאי מחקר קפדני ומיומן. ריכוזים מגיב נכון ותנאים PCR, תיוג, הכלאה הם קריטיים. פרוטוקול Virochip ניתן לשנות בקלות כדי להתאים ניתוח לרקמות החולות על ידי השימוש בשיטה רקמה מיצוי כגון TRIzol (Invitrogen) להפקת חומצות גרעין. בדיקות ניתן להוסיף או נמחקו כנדרש בכדי להשיג את הספקטרום הרצוי ולרוחבה של הסיקור, למשל, בדיקות לגילוי מטרות nonviral כגון חיידקים ופטריות יכול להיות מתוכנן, והוסיף "ב-the-fly". יישומים מסוימים של assay Virochip בשלבי פיתוח כוללים קשת רחבה אבחון ויראלי במעבדה קלינית, חקירה פרוץ, הקרנת טוהר של תרופות וחיסונים, גילוי נגיפי רומן הפתוגן.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דוד וואנג, אנטולי Urisman, איימי Kistler, קייל פישר, פטריק טאנג, ואלכסנדר Greninger לפיתוח אופטימיזציה ראשונית של פרוטוקול Virochip. עבודה זו נתמכת על ידי K08 NIH מענק פרס אבוט דיסקברי (עד CC) לבין הווארד יוז רפואי במכון (עד JLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
