Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen
Summary
De Virochip is een pan-virale microarray ontworpen om gelijktijdig alle bekende virussen, alsmede nieuwe virussen te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie. Hier laten we zien hoe een Virochip test uitvoeren om klinische monsters te analyseren op de aanwezigheid van zowel bekende als onbekende virussen.
Abstract
De diagnose van virale oorzaken van veel besmettelijke ziekten is het moeilijk te wijten aan de inherente volgorde diversiteit van virussen, alsook de voortdurende opkomst van nieuwe virale pathogenen, zoals SARS coronavirus en 2009 pandemische H1N1-influenzavirus, die niet opspoorbaar zijn door de traditionele methoden. Om deze uitdagingen, hebben we eerder ontwikkeld en gevalideerd een pan-virale microarray platform genaamd de Virochip met de capaciteit om alle bekende virussen, alsmede nieuwe varianten te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie 1. Met behulp van de Virochip, hebben we het volledige spectrum van virussen geassocieerd met infecties van de luchtwegen, met inbegrip van gevallen van onverklaarbare kritieke ziekte in het ziekenhuis opgenomen patiënten, met een gevoeligheid gelijk is aan of beter dan de conventionele klinische tests 2-5. De Virochip is ook gebruikt om nieuwe virussen te identificeren, met inbegrip van het SARS-coronavirus 6,7, een roman rhinovirus clade 5, XMRV (een retrovirus gekoppeld aan prostaatkanker) 8, Avian Borna Virus (de oorzaak van een slopende ziekte in papegaaien) 9, en een nieuwe cardiovirus bij kinderen met ademhalings-en diarree 10. De huidige versie van de Virochip is geschikt gemaakt voor een Agilent microarray platform en bestaat uit ~ 36.000 probes afgeleid van meer dan ~ 1500 virussen in GenBank ingang van december 2009. Hier laten we zien de stappen die betrokken zijn bij de verwerking van een Virochip test van start tot finish (~ 24 uur doorlooptijd), met inbegrip van steekproefsgewijze nucleïnezuur-extractie, PCR-amplificatie met behulp van willekeurige primers, fluorescente kleurstof oprichting, en microarray hybridisatie, scannen en analyse.
Protocol
Discussion
De Virochip protocol zoals hier beschreven is complex en vereist een zorgvuldige en vakkundige research analist. De juiste reagens concentraties en de voorwaarden voor PCR, etikettering, en hybridisatie zijn van cruciaal belang. De Virochip protocol kan eenvoudig worden aangepast om de analyse van zieke weefsels door het gebruik van een tissue-extractie methode zoals TRIzol (Invitrogen) voor nucleïnezuur extractie tegemoet te komen. Probes kunnen worden toegevoegd of verwijderd als nodig is om het gewenste spectrum en de breedte van de dekking te verkrijgen, bijvoorbeeld, probes voor de detectie van niet-virale doelstellingen zoals bacteriën en schimmels kunnen worden ontworpen en toegevoegd "on-the-fly". Enkele toepassingen van de Virochip test momenteel in ontwikkeling zijn onder een breed spectrum virale diagnostiek in het klinisch laboratorium, onderzoeken van uitbraken, zuiverheid screening van geneesmiddelen en vaccins, en nieuwe virale ziekteverwekker ontdekking.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, en Alexander Greninger voor de initiële ontwikkeling en optimalisatie van de Virochip protocol. Dit werk wordt ondersteund door een NIH K08 subsidie en Abbott Discovery Award (voor CC) en de Howard Hughes Medical Institute (tot JLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
