Le Virochip est une puce pan-viral conçu pour détecter simultanément tous les virus connus ainsi que de nouveaux virus sur la base d'une homologie de séquence conservée. Ici, nous montrent comment exécuter un test Virochip pour analyser des échantillons cliniques pour la présence de virus connus et inconnus.
Le diagnostic des causes virales de nombreuses maladies infectieuses est difficile en raison de la diversité des séquences inhérentes de virus ainsi que l'émergence continue de nouveaux agents pathogènes viraux, tels que le coronavirus du SRAS et de grippe pandémique H1N1 2009 virus, qui ne sont pas détectables par les méthodes traditionnelles. Pour relever ces défis, nous avons précédemment développé et validé une plateforme biopuces pan-virale appelée Virochip avec la capacité de détecter tous les virus connus ainsi que de nouveaux variants sur la base d'une homologie de séquence conservée 1. Utilisation de la Virochip, nous avons identifié le spectre complet des virus associés à des infections respiratoires, y compris des cas de maladie grave inexpliquée chez les patients hospitalisés, avec une sensibilité équivalente ou supérieure à 2-5 tests cliniques classiques. Le Virochip a également été utilisé pour identifier de nouveaux virus, y compris le coronavirus du SRAS 6,7, un clade rhinovirus roman 5, XMRV (un rétrovirus liés à la prostate) 8, bornavirus aviaire (la cause d'une maladie débilitante chez les perroquets) 9, et un roman dans cardiovirus enfants souffrant de maladies respiratoires et diarrhéiques 10. La version actuelle de la Virochip a été porté à une plateforme Agilent microarray et se compose de 36 000 ~ sondes issues de plus de 1500 ~ virus dans GenBank à partir de Décembre 2009. Nous montrerons les étapes impliquées dans le traitement d'un test Virochip du début à la fin (temps ~ retournement 24 heures), y compris l'extraction des acides nucléiques de l'échantillon, l'amplification par PCR utilisant des amorces aléatoires, l'incorporation de colorants fluorescents, et l'hybridation biopuces, de numérisation et d'analyse.
Le protocole Virochip comme décrit ici est complexe et nécessite un technicien de recherche minutieux et compétent. Concentrations de réactifs et des conditions correctes pour la PCR, l'étiquetage, et l'hybridation sont critiques. Le protocole Virochip peut être facilement modifié pour accueillir l'analyse des tissus malades par l'utilisation d'une méthode d'extraction des tissus tels que Trizol (Invitrogen) pour l'extraction des acides nucléiques. Les sondes peuvent être ajoutées ou supprimées au besoin d'obtenir le spectre désiré et l'étendue de la couverture, par exemple, des sondes pour la détection de cibles non viraux tels que les bactéries et les champignons peuvent être conçus et ajouté «à la volée". Certaines applications de l'analyse Virochip actuellement en développement comprennent large spectre diagnostic des maladies virales dans les laboratoires cliniques, l'investigation des flambées, le dépistage pureté des médicaments et des vaccins, et la découverte de nouveaux agents pathogènes viraux.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, et Alexander Greninger pour le développement initial et l'optimisation du protocole Virochip. Ce travail est soutenu par une subvention du NIH K08 et Abbott Discovery Award (pour CC) et le Howard Hughes Medical Institute (au JLD).
Name of reagent / material | Name of reagent / material |
---|---|
PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL water | |
0.5 μL 0.1M DTT | |
0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
3.8 μL water | |
0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
1 μL 100 pmol / μL primer B | |
1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
37 μL water | |
Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
Add water to total volume of 25 μL | |
Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |