Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов
Summary
Virochip является пан-вирусных микрочипов предназначен для одновременного обнаружения всех известных вирусов, а также новыми вирусами на основе сохранения гомологии последовательности. Здесь показано, как запустить анализ Virochip для анализа клинических образцов на наличие известных и неизвестных вирусов.
Abstract
Диагноз вирусного причины многих инфекционных заболеваний, трудно из-за присущего разнообразию последовательности вирусов, а также текущие появление новых вирусных патогенов, таких как атипичная пневмония коронавирус и 2009 пандемии вирус гриппа H1N1, которые не обнаруживаются традиционными методами. Для решения этих задач, мы уже разработаны и утверждены пан-вирусных микрочипов платформу под названием Virochip со способностью обнаруживать все известные вирусы, а также новые варианты на основе сохранения гомологии последовательности 1. Использование Virochip, мы определили весь спектр вирусов связано с респираторными инфекциями, в том числе случаи необъяснимых критических заболеваний у госпитализированных пациентов, при этом чувствительность равна или превосходит обычные клинические 2-5 тестирования. Virochip также используется для выявления новых вирусов, в том числе ОРВИ коронавирус 6,7, роман клады риновирусов 5, XMRV (ретровирус, связанных с раком предстательной железы) 8, птичий bornavirus (причина изнуряющая болезнь у попугаев) 9, и роман cardiovirus у детей с респираторными и желудочно-кишечные заболевания 10. Текущая версия Virochip была портирована на платформу Agilent микрочипов и состоит из ~ 36000 зондов производным от более чем ~ 1500 вирусов в GenBank по состоянию на декабрь 2009 года. Здесь мы показываем, этапы обработки анализа Virochip от начала до конца (~ 24 час времени оборота), в том числе образцы нуклеиновых кислот, ПЦР-амплификации с использованием случайных праймеров, флуоресцентный краситель регистрации, и микрочипов гибридизации, сканирование и анализ.
Protocol
Discussion
Virochip протокол, как описано здесь является сложным и требует тщательного и квалифицированного исследования техник. Правильная концентрация реагента и условий для ПЦР, маркировки и гибридизации являются критическими. Протокол Virochip могут быть легко изменены, чтобы приспособить анализа больные ткани с использованием метода извлечения ткани, такие как TRIzol (Invitrogen) для выделения нуклеиновых кислот. Зонды могут быть добавлены или удалены, сколько необходимо для получения желаемого спектра и широта охвата, например, зонды для обнаружения невирусные целей, таких как бактерии и грибки могут быть разработаны и добавил, "на лету". Некоторые приложения анализа Virochip в настоящее время в стадии разработки включают широкий спектр вирусных диагностики в клинической лаборатории, расследования вспышек, чистота скрининга лекарственных препаратов и вакцин, и новые вирусные открытия возбудителя.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим David Wang, Анатолий Urisman, Эми Kistler, Кель Фишер, Патрик Танг, и Александр Greninger для первоначальной разработки и оптимизации протокола Virochip. Эта работа проводится при поддержке гранта NIH K08 и Abbott Discovery Award (в КС) и Медицинского института Говарда Хьюза (для JLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
