Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali
Summary
Il Virochip è un pan-virale microarray progettati per rilevare contemporaneamente tutti i virus conosciuti e nuovi virus sulla base di omologia di sequenza conservati. Qui mostriamo come eseguire un test Virochip per analizzare i campioni clinici per la presenza di virus noti e sconosciuti.
Abstract
La diagnosi di cause virali di molte malattie infettive è difficile a causa della intrinseca diversità sequenza di virus così come l'emergere continuo di nuovi agenti patogeni virali, come la SARS coronavirus e il 2009 pandemia di H1N1 virus dell'influenza, che non sono rilevabili con i metodi tradizionali. Per affrontare queste sfide, abbiamo precedentemente sviluppato e validato un pan-virale piattaforma microarray chiamato Virochip con la capacità di rilevare tutti i virus conosciuti così come le varianti romanzo sulla base di omologia di sequenza conservati 1. Utilizzando il Virochip, abbiamo identificato l'intero spettro dei virus associati con infezioni respiratorie, compresi i casi di inspiegabili malattia critica nei pazienti ospedalizzati, con una sensibilità pari o superiore a 05/02 convenzionali test clinici. Il Virochip è stato utilizzato anche per identificare nuovi virus, tra cui il coronavirus della SARS 6,7, un clade rinovirus romanzo 5, XMRV (un retrovirus collegato al cancro della prostata) 8, bornavirus aviaria (la causa di una malattia devastante in pappagalli) 9, e un cardiovirus romanzo in bambini con malattie respiratorie e diarrea 10. La versione attuale del Virochip è stato portato su una piattaforma microarray Agilent ed è costituito da ~ 36.000 sonde derivanti da più di ~ 1.500 virus in GenBank a partire dal dicembre del 2009. Qui mostriamo i passaggi necessari per l'elaborazione di un saggio Virochip dall'inizio alla fine (i tempi di consegna ~ 24 ore), tra cui l'estrazione degli acidi nucleici del campione, amplificazione PCR con primer random, incorporazione colorante fluorescente, e l'ibridazione microarray, scansione e analisi.
Protocol
Discussion
Il protocollo Virochip come descritto qui è complessa e richiede un tecnico di ricerca meticolosa e competente. Concentrazioni dei reagenti corrette e le condizioni per la PCR, l'etichettatura, e l'ibridazione sono critici. Il protocollo Virochip può essere facilmente modificato per ospitare l'analisi dei tessuti malati con l'uso di un metodo di estrazione dei tessuti come TRIzol (Invitrogen) per l'estrazione degli acidi nucleici. Sonde possono essere aggiunti o eliminati come necessario per ottenere lo spettro desiderato e l'ampiezza di copertura, per esempio, sonde per la rilevazione di bersagli non virali come batteri e funghi possono essere progettati e ha aggiunto "on-the-fly". Alcune applicazioni del test Virochip attualmente in fase di sviluppo includono ampio spettro diagnostica virale nel laboratorio clinico, focolaio, lo screening della purezza di farmaci e vaccini, e la scoperta di nuovi agenti patogeni virali.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, e Alexander Greninger per lo sviluppo iniziale e l'ottimizzazione del protocollo Virochip. Questo lavoro è supportato da un K08 NIH concessione e Abbott Discovery Award (per CC) e l'Howard Hughes Medical Institute (a JLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
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