باستخدام الفحص ميكروأري عموم الفيروسي (Virochip) إلى الشاشة العينات السريرية لمسببات الأمراض الفيروسية
Summary
وVirochip هو ميكروأري عموم الفيروسية في وقت واحد تهدف إلى الكشف عن جميع الفيروسات المعروفة فضلا عن الفيروسات الجديدة على أساس التماثل تسلسل الحفظ. نحن هنا لشرح كيفية تشغيل مقايسة Virochip لتحليل العينات السريرية عن وجود الفيروسات المعروفة وغير المعروفة على حد سواء.
Abstract
تشخيص الأسباب الفيروسية العديد من الأمراض المعدية من الصعب نظرا للتنوع الفيروسات الكامنة في التسلسل ، وكذلك ظهور مسببات الأمراض الفيروسية الجارية الرواية ، مثل السارس التاجى و 2009 باء فيروس أنفلونزا H1N1 ، التي لا يمكن كشفها بواسطة الطرق التقليدية. لمواجهة هذه التحديات ، وضعنا في السابق والتحقق من صحة منصة ميكروأري عموم الفيروسي يسمى Virochip لديها القدرة على كشف جميع الفيروسات المعروفة فضلا عن المتغيرات الجديدة على أساس التماثل تسلسل الحفظ 1. باستخدام Virochip ، حددنا مجموعة كاملة من الفيروسات المرتبطة التهابات الجهاز التنفسي ، بما في ذلك حالات الأمراض الخطيرة غير المبررة في المرضى في المستشفى ، مع حساسية يعادل أو يفوق 05/02 التقليدية الاختبارات السريرية. كما تم Virochip المستخدمة لتحديد الفيروسات الجديدة ، بما في ذلك التاجى السارس 6،7 ، وهي رواية فيروسات الانف كليد 5 ، XMRV (أ الارتجاعي مرتبطة بسرطان البروستاتا) 8 ، bornavirus الطيور (سبب مرض الهزال في الببغاوات) 9 ، وcardiovirus الرواية في الأطفال الذين يعانون من أمراض الجهاز التنفسي والإسهال 10. وقد استدار الإصدار الحالي من Virochip إلى منصة ميكروأري اجيلنت وتتكون من 36000 تحقيقات ~ المستمدة من الفيروسات أكثر من 1500 ~ في بنك الجينات اعتبارا من شهر ديسمبر من عام 2009. نحن هنا لشرح الخطوات المتبعة في معالجة مقايسة Virochip من البداية الى النهاية (~ الزمنية 24 ساعة) ، بما في ذلك استخراج عينة الحمض النووي ، PCR التضخيم باستخدام بادئات عشوائية ، إدماج صبغة الفلورسنت ، وتهجين ميكروأري والمسح الضوئي والتحليل.
Protocol
Discussion
بروتوكول Virochip كما هو موضح هنا أمر معقد ويتطلب البحث الدقيق فني ومهارة. تركيزات الكاشف الصحيح وشروط PCR ، ووضع العلامات ، وتهجين حاسمة. ويمكن للبروتوكول Virochip تعديلها بسهولة لاستيعاب تحليل الأنسجة المريضة عن طريق استخدام أنسجة طريقة استخراج مثل TRIzol (Invitrogen) لاستخراج الحمض النووي. يمكن إضافة أو حذف تحقيقات حسب الضرورة للحصول على الطيف الترددي المطلوب واتساع التغطية ، على سبيل المثال ، يمكن تصميم تحقيقات للكشف عن الأهداف nonviral مثل البكتيريا والفطريات ، وأضاف "على ذبابة". بعض التطبيقات للمقايسة Virochip حاليا قيد التطوير واسع الطيف يشمل التشخيص الفيروسي في المختبرات السريرية ، والتحقيق الفاشية ، وفحص نقاء الأدوية واللقاحات ، واكتشاف العوامل المسببة للأمراض الفيروسية الرواية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ديفيد وانغ ، Urisman أناتولي كيستلر آمي فيشر Kael ، تانغ باتريك ، وGreninger الكسندر لتطوير والتحسين الأولي للبروتوكول Virochip. ويدعم هذا العمل عن طريق منحة المعاهد الوطنية للصحة وK08 ابوت جائزة ديسكفري (لCC) ومعهد هوارد هيوز الطبي (لJLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
- Wang, D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).
- Chiu, C. Y. Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray. J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).
- Chiu, C. Y. Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult. Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).
- Chiu, C. Y. Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children. J Pediatr. 153, 76-83 (2008).
- Kistler, A. Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity. J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).
- Rota, P. A. Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. Science. 300, 1394-1399 (2003).
- Wang, D. Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays. PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).
- Urisman, A. Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant. PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).
- Kistler, A. L. Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent. Virol J. 5, e25-e25 (2008).
- Chiu, C. Y. Identification of cardioviruses related to Theiler’s murine encephalomyelitis virus in human infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).
- Urisman, A. E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns. Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).
