ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

Virochipアッセイの手順は、臨床サンプルから（1）核酸の抽出、抽出したRNAの（2）逆転写および第2鎖cDNA合成、ランダムプライミングcDNAの（3）PCR増幅、（3）Cy3の蛍光色素の取り込みを含む、（4）Virochipマイクロアレイの標識物質のハイブリダイゼーション、及び（5）スキャンおよび分析（図1）。以下に示すプロトコルは、インフルエンザ様疾患を持つ子どもから鼻腔スワブサンプルのVirochipアッセイの使いかたを説明します。 プライマー配列プライマー5' – GTTTCCCAGTCACGATA -（N 9）-3' プライマーB 5' – GTTTCCCAGTCACGATA – 3' 1。核酸抽出これらのサンプルは潜在的に感染であるため、臨床検体からの核酸の抽出は、バイオセーフティレベル2（BSL – 2）以上の条件の下で実行する必要があります。 鼻腔スワブサンプルは、ウイルス保持媒体で転送されます。 1.5mlのエッペンドルフマイクロ遠心チューブに試料のアリコート200μLの。 オプション：0.22μmフィルター（ウイルス粒子のために精製するために）を通過サンプル オプション：製造業者の指示に従って、ターボDNアーゼキット（Ambion社）を用いてDNaseで前処理サンプル（ホストのゲノムDNAを分解すると、保護された、capsidに包まれたウイルス核酸のために精製するために） Zymo ZRウイルスRNA抽出キットまたは、製造元の指示に従ってキアゲンUltrasensウイルスキットを使用してサンプルを抽出する。 2。逆転写および第2鎖cDNA合成（"ラウンドA"） RNAを抽出した4ユニットに1 uLの40μL/ pmolのプライマーを追加。 65〜熱が° Cクラー（例：ジーンアンプPCRシステム9700）とその後の5分間室温温度× 5分で冷ます。 2μL5X RTバッファー、1μL12.5mmのdNTPを、1μL水、0.5μL0.1M DTT、および0.5μLSSIII RT（Invitrogen社）で構成されたマスターミックスの5μLを追加。 42℃でインキュベート℃× 60分。 プログラム可能なサーマルサイクラーで、94〜熱10℃まで冷却C × 2分（中止に逆転写酵素反応）、° C、パルス遠心分離し、1μL5Xシークエナーゼのバッファで構成される5μLシークエナーゼミックスを追加し、3.8μL水、および0.15μLシーケナーゼ（USB社）。第2鎖合成の場合は、° C〜37 ° Cから8分、8分を保持し、94への熱は、° C × 2分（シークエナーゼを不活性化する）と10 ° C（保持）へのクールな上の10から立ち上がる。 省略可能 ：RD cDNAサンプルは-20℃で、この時点で保存することができます。 3。ランダムプライミングcDNAのPCR増幅（"ラウンドB"） 5μL10X PCRバッファー、1μL12.5mmのdNTPを 、1μLは100pmol /μLプライマーB、1μLKlenTaq LA（Sigma社）、および37μLの水から成るマスターミックス45μLにRdの5μlのサンプルを追加。 次のようにPCRプロトコール実行：94 ° C、2分→（94の25サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド） 1.5％アガロース電気泳動ゲル上のRD Bのサンプルを確認してください。約200から塗抹標本 – 1000 BPは可視でなければなりません（図2A） 4。 Cy3の蛍光色素の取り込み オプション ：別のサンプルは、Cy5の蛍光色素で標識し、同じマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。 AA – dNTPを組み込むには、5μlの10 × PCRバッファー、1μlの12.5mmのAA – dNTPを （Invitrogen社製）、1μlのは100pmol / ULプライマーB、1から成るマスターミックスの45 ULに路Bのサンプルを5 ULを追加する1μlのKlenTaq LA（Si​​gma社）、および37 uLの水。 PCRプロトコールを以下のように実行する：94 ° C、2分→（94の15サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド） メーカーの指示ごとにクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）DNAと路Cのサンプルを清掃してください。 10μLで溶出します。 路Cのサンプルに1M炭酸水素1 UL（Sigma社）および1μlのCy5と（GE Healthcare）を追加します。 暗所でインキュベート× 1時間。 メーカーの指示に従ってDNAクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）とCy3標識サンプルを清掃してください。 12μLで溶出します。 5。 Virochipマイクロアレイへのハイブリダイゼーション オプション：（サンプルの正規化のための）光度計分光光度計に組み込まれたcDNA濃度と色素の量をチェックするために1.5μLを使用してください PCRストリップチューブに25μLの全体積（アジレント）に1μL25Xフラグメンテーションバッファ、5μL5Xブロッキング緩衝液、Cy3標識サンプルの9.5μL（または正規化する量）、及び水を加える 2X GEXのハイブリダイゼーションバッファー（アジレント）の25μLを追加。気泡を除去するために一時的にスピンダウン。 ガスケットスライド上にサンプル40μLをロードする。 場所アジレント印刷さVirochipの配列（Californi大学、サンフランシスコ/アジレント）（ダウン"アジレント"マーク側）ガスケットのスライドの上とは、しっかりとネジを締めます。 65で一晩ハイブリダイズ℃のオーブン、10 rpmで速度設定。 37℃に配列、予熱バッファ2（アジレント）を洗浄するバッファ1（アジレント）のガスケットのスライド/配列サンドイッチ水中を離れてください。バッファ1 × 1分を洗ってください。予熱されたバッファ2 × 1分で洗浄する。徐々に（直接配列のアクティブな側面に触れないように注意しながら余分な水分を逃がすためにキムワイプを使用）気泡に注意しながら、バッファ2からスライドを削除するスライドホルダーにス​​ライドを配置し、アレイスキャナーに挿入。 6。 Virochipスキャンと分析スキャンCy3標識測定器の標準のスキャンプロトコル（図2B）によるとは5μmまたは2μm以下で配列。 E -予測11、目視検査、クラスター分析、または自動化されたVirochip解析プログラムによってVirochipマイクロアレイを解析する。これらの3つの方法のそれぞれによって、インフルエンザウイルスは、容易に鼻腔スワブサンプル（インフルエンザ様疾患を持つ子から）（図2C）で検出される 7。代表的な結果： プロトコルが正しく行われている場合、スミアは、RD Bのステップ（図2A）の後にアガロースゲル電気泳動で見られるべきである。 Agilentのプラットフォーム上でVirochipマイクロアレイは、（図2B）視覚的に分析することは困難になりますが、ウイルスが存在しているなら、それは容易に目視検査、クラスター分析、および/またはE – Predictは（図1C）で識別する必要があります。アッセイの陽性コントロールとして、サンプルは、既知のウイルス（MS2バクテリオファージなどのタバコモザイクウイルス）からの核酸の測定された量で添加することができます。 図1。 Virochipマイクロアレイの処理と分析の概略図。臨床サンプルから核酸を抽出は無作為に、増幅蛍光色素で標識し、Virochipマイクロアレイにハイブリダイズさせる。マイクロアレイは、2μmの解像度でスキャンし、E -予測を含め、計算ツールのさまざまな方法を使って分析されます。 図2。 Virochipアッセイの手順は、ランダムPCR、200の塗抹標本による増幅後- 。1000bpのゲル電気泳動によって可視化することができます（）（B）8アレイ/スライドガラスの三Virochipマイクロアレイアウトは、小さな地域で、示されている。右下の隅に挿入で吹き、最大1マイクロアレイの。臨床検体中のインフルエンザウイルスの存在を明らかにE -予測。使用して（C）自動化されたマイクロアレイウイルス分析高い類似度スコア（S = 0.55）ため、この非常に重要な予測を作る、ゼロに近いp値に対応しています。