El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales
Summary
El Virochip es un microarray de pan-viral diseñada para detectar de forma simultánea todos los virus conocidos, así como nuevos virus sobre la base de la homología de secuencia conservada. Aquí se demuestra cómo ejecutar un ensayo de Virochip para analizar las muestras clínicas para determinar la presencia de virus conocidos y desconocidos.
Abstract
El diagnóstico de la causa viral de muchas enfermedades infecciosas es difícil debido a la secuencia de la diversidad inherente a los virus, así como la aparición continua de nuevos patógenos virales, como el coronavirus del SRAS y 2009, la pandemia del virus H1N1 de la gripe, que no son detectables por los métodos tradicionales. Para enfrentar estos desafíos, ya hemos desarrollado y validado una plataforma de microarrays pan-viral llamada Virochip con la capacidad de detectar todos los virus conocidos, así como nuevas variantes sobre la base de la homología de secuencia conservada 1. Utilizando el Virochip, hemos identificado la gama completa de los virus asociados con las infecciones respiratorias, incluyendo los casos de enfermedades inexplicables crítico en los pacientes hospitalizados, con una sensibilidad igual o superior a 5.2 convencionales de ensayos clínicos. El Virochip también se ha utilizado para identificar nuevos virus, incluyendo el coronavirus del SRAS 6,7, un clado rinovirus novela 5, XMRV (un retrovirus relacionados con el cáncer de próstata) 8, bornavirus aviar (la causa de una enfermedad degenerativa en los loros) 9, y una novela Cardiovirus en niños con enfermedades respiratorias y diarreicas 10. La versión actual de la Virochip ha sido portado a una plataforma de microarrays de Agilent y consta de ~ 36.000 sondas derivadas de más de ~ 1.500 virus en el GenBank de diciembre de 2009. Aquí nos demuestran los pasos a seguir en el procesamiento de un ensayo de Virochip de principio a fin (~ 24 horas el tiempo de entrega), incluyendo la extracción de ácidos nucleicos de muestras, amplificación por PCR utilizando cebadores aleatorios, la incorporación de un colorante fluorescente, y la hibridación de microarrays, la exploración y el análisis.
Protocol
Discussion
El protocolo Virochip como se describe aquí es complejo y requiere un técnico de investigación meticulosa y especializada. La concentración correcta de los reactivos y las condiciones de PCR, el etiquetado y la hibridación son críticos. El protocolo Virochip se puede modificar fácilmente para adaptarse a un análisis de los tejidos enfermos mediante el uso de un método de extracción de tejidos, tales como TRIzol (Invitrogen) para la extracción de ácidos nucleicos. Las sondas se pueden añadir o eliminar si es necesario para obtener el espectro deseado y amplitud de la cobertura, por ejemplo, las sondas de detección de blancos no virales tales como bacterias y hongos pueden ser diseñados y agregó que "en la marcha". Algunas aplicaciones de la prueba Virochip actualmente en desarrollo incluyen un amplio espectro de diagnóstico viral en el laboratorio clínico, investigación de brotes, detección pureza de las drogas y vacunas, y el descubrimiento de nuevos patógenos virales.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a David Wang, Urisman Anatoly, Amy Kistler, Fischer Kael, Patrick Tang, y Greninger Alexander para el desarrollo inicial y la optimización del protocolo de Virochip. Este trabajo es apoyado por una subvención del NIH K08 y el Premio Descubrimiento Abbott (de CC) y el Instituto Médico Howard Hughes (a JLD).
Materials
| Name of reagent / material | Name of reagent / material |
|---|---|
| PrimerA | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9)-3′ |
| Primer B | 5′-GTTTCCCAGTCACGATA-3′ |
| RT Master Mix (5 μL) | 2 μL 5X RT buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL water | |
| 0.5 μL 0.1M DTT | |
| 0.5 μL SSIII RT (Invitrogen) | |
| Sequenase Mix (5 μL) | 1 μL 5X Sequenase buffer |
| 3.8 μL water | |
| 0.15 μL Sequenase (USB Corporation) | |
| Rd B PCR Master Mix (45 μL) | 5 μL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Rd C PCR Master Mix (45 μL) | 5 uL 10X PCR buffer |
| 1 μL 12.5 mM dNTP (Invitrogen) | |
| 1 μL 100 pmol / μL primer B | |
| 1 μL KlenTaq LA (Sigma) | |
| 37 μL water | |
| Hybridization buffer (25 μL) | 1 μL 25X fragmentation buffer (Agilent) |
| 5 μL 5X blocking buffer (Agilent) | |
| 9.5 μL (or amount to normalize) of Cy3-labeled sample | |
| Add water to total volume of 25 μL | |
| Agilent Virochip microarray | license pending; available from Chiu laboratory, UCSF |
References
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