Een alternatieve cultuur methode om Genomic Hypomethylation van muis embryonale stamcellen met MEK-remmer PD0325901 en vitamine C

ES-cellen zijn afkomstig uit de ICM een blastocyst-¹. De cellen kunnen in een Braziliaanse pluripotent zijn en alle somatische lineages en germline cellen². Oprichting van ES-cellen biedt de mogelijkheid te onderzoeken van de ontwikkeling processen in vitro en cellen voor medische relevantie voor regeneratieve geneeskunde op basis van hun pluripotent³kan genereren.

Twee groepen seminally de muis ES-cellijnen opgericht in 1981 en wanneer cellen afgeleid van het vroege embryo muis werden gekweekt in de foetale runderserum (FBS)-met medium met muis embryonale fibroblasten (MEFs) als de feeder laag^1,4 . MEFs mitotically waren geïnactiveerd en vooraf waren gegroeid in gerechten vóór het kweken van ES-cellen. MEFs ondersteuning voor muis ES cel bijlage en produceren van groeifactoren te bevorderen van voortplanting en onderdrukken de differentiatie⁵, terwijl FBS essentiële trofische factoren en hormonen voor celproliferatie biedt. Latere studies aangegeven dat LIF geproduceerd door feeder cellen de belangrijkste cytokine voor zelf-vernieuwing en onderhoud van pluripotent in muis ES-cellen was, en de toevoeging van LIF in het medium voor feeder cellen^{6 vervangen kon}. Het uithoudingsvermogen van muis ES cellen in FBS/LIF medium op feeders is momenteel nog steeds de standaard methode die door veel onderzoekers aangenomen. Echter, sommige problemen met deze benadering van de klassieke cultuur. Ten eerste, feeder cellen afscheiden van overtollige en ongecontroleerde factoren en pathogene besmetting⁷kunnen veroorzaken. Om te voorkomen dat deze inmenging, coating het oppervlak van gerechten met gelatine en de toevoeging van LIF in serum-bevattende medium zijn alternatieve methoden voor het behoud van de muis ES cellen zonder feeder-laag cellen. Bovendien vertonen de muis ES cellen geteeld onder omstandigheden van de serum/LIF morfologische heterogeniteit in cel populaties, en zelfs in de mate van expressie van pluripotent-gerelateerde factoren⁸. Recente studies suggereren dat onder omstandigheden van de serum/LIF, de kern pluripotent-gerelateerde transcriptiefactoren (met inbegrip van SOX2, Nanog en OCT4) de pluripotent door middel van LIF en WNT signalering ondersteunen kunnen; echter, met name, zij ook activeren een fibroblast groeifactor (FGF) signaal om differentiatie⁸trigger. Als gevolg van de ambivalente dubbele actie van de kern transcriptiefactoren, muis ES cellen gekweekt in het serum aanwezig heterogeniteit, bestaande uit twee verwisselbare populaties, een soortgelijk aan ICM en een ander lijkt de op de voorbehandelde epiblast staat⁸. Bovendien, muis ES cellen in serum vertonen vaak global hypermethylation⁹, overwegende dat ICM en PGCs zijn in een staat van de wereldwijde hypomethylated, die nauw is met hun pluripotent^{9,10 verbonden}.

Er is een aanzienlijke vraag naar het ontwikkelen van nieuwe methoden voor het kweken van muis ES-cellen. Diverse verbeterde protocollen zijn vastgesteld sinds 2003¹¹ maar er nog steeds enkele beperkingen en tekortkomingen⁷. Sinds 2008, het gecombineerde gebruik van twee kleine-molecuul kinase-remmers, PD0325901 (de Inhibitor van de omwenteling van de mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (MAPK) / extracellulaire-signaal-gereglementeerde kinase (ERK) (MEK)) en CHIR99021 (de Inhibitor van de omwenteling van glycogeen synthase kinase 3 (GSK3)), in N₂B₂₇ medium met LIF en zonder serum voor kweken muis ES^{12 cellen}nieuwe perspectieven heeft geopend. Deze nieuwe beschreven medium wordt gekenmerkt door het gebruik van twee remmers (2i). Muis ES-cellen gekweekt in 2i/LIF medium zijn meer homogeen in cel populaties en de uitdrukking van pluripotent factoren. Daarnaast vertonen 2i/LIF-gekweekte muis ES-cellen DNA hypomethylation wereldwijd, die dichter bij ICM-achtige cellen^9,13is. Zelfs zo, heeft 2i cultuur zijn nadelen. PD0325901 en CHIR99021 zijn onoplosbaar in water en in het algemeen worden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO)-op basis van de stamoplossing te voegen in een kweekvloeistof. Studies hebben aangetoond dat langdurig en lage dosis blootstelling van cellen aan DMSO kan leiden tot cytotoxiciteit¹⁴.

Hier, we twee kleine-molecuul verbindingen gebruikt en ontwikkelde een nieuwe methode van de cultuur van muis ES-cellen. De nieuwe cultuur methode combineert Vc en MEK-remmer PD0325901 ter bevordering van DNA hypomethylation snel en doeltreffend tot een vergelijkbaar niveau van PGC, genoemd als het protocol voor het kweken van Vc/PD0325901. Muis ES cellen in serum-bevattende medium Vc/PD0325901-toegevoegde vertonen homogeniteit in de morfologie en zijn opgelopen in een grondtoestand. Vergeleken met 2i cultuur, muis ES cellen gekweekt onder Vc/PD0325901 voorwaarden vertonen sneller kinetiek van DNA-demethylatie en het hypomethylation niveau vergelijkbaar met die van PGC kunnen bereiken. Bovendien, het gebruik van een enkele inhibitor (PD0325901) vermindert de input DMSO tot medium in vergelijking met die gebruikt in 2i (PD0325901/CHIR99021) en vermindert de schade aan cellen.