MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド
Summary
我々 はマウス胚性幹細胞を培養するための 2 つの化学ベースのプロトコルについて説明します。この新しいメソッドは、(ビタミン C)、テトを介した酸化を促進し、DNA 低いメチル化とマウス胚性幹細胞の多能性を維持するために、5-メチルシトシン (PD0325901) でのデノボ合成を抑制の相乗効果のメカニズムを利用しています。
Abstract
胚性幹 (ES) 細胞は 3 つの胚葉 (内胚葉、中胚葉、または外胚葉) のいずれかに分化する可能性があるし、再生医療のための多くの系統を生成できます。ES 細胞培養体外長い広範な懸念の対象とされています。血清及び白血病抑制因子 (LIF) のマウス ES 細胞を維持する古典的な-媒体を含んでいます。しかし、血清/LIF の条件下で細胞は形態および多能性関連遺伝子の発現プロファイルの不均一性を示す、主に準安定状態。さらに、ES 細胞を示すグローバル領域のメチル化が、内部細胞塊 (ICM) の始原生殖細胞 (PGCs) 素朴な ES 細胞は、グローバルの低いメチル化の状態。ICM と始原生殖の hypomethylated 状態は、多能性と密接に関連します。マウス ES 細胞培養方法を改善するために DNA hypomethylated および多能性の状態を維持するために 2 つの低分子化合物の選択的に結合された使用率に基づいて新しい方法最近行った。ここでは、ビタミン C (Vc) の共同治療を示す、PD0325901 はマウス ES 細胞で 5 日で 5-メチルシトシン (5mC) の約 90% を消去できます。生成された 5mC コンテンツは孵卵に匹敵します。PD0325901 アップ調整をする Prdm14 式 Dnmt3b を抑制する制御機構の解明を示します (de novo DNA メチル基転移酵素)、Dnmt3l (Dnmt3b の補因子)、 de novo 5mC 合成を減らすことによって。Vc は、パッシブとアクティブの両方の DNA demethylations の関与を示す 5mC の 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) 主に Tet1 と Tet2、触媒への変換を促進します。さらに, Vc/PD0325901 の条件下でマウス ES 細胞示す同種形態と多能性の状態。総称して、小説と DNA 低いメチル化とマウス ES 細胞の多能性を維持達成するため化学シナジー培養法を提案します。小分子の化学依存法は、血清が文化、さらに臨床応用研究のための均質な ES 細胞を生成する将来性の主要な欠点を克服します。
Introduction
ES 細胞は胚盤胞1の ICM に由来します。細胞は多能性の状態で、すべての体細胞系列と生殖細胞2を形成することができます。ES 細胞の樹立は、開発を調査する機会の in vitroを処理し、多能性3に基づく再生医療医療関連性の細胞を生成することができますを提供します。
2 つのグループは、1981 年にマウス ES 細胞を形づくる設立し、初期のマウス胚由来細胞がウシ胎児血清 (FBS) で培養したとき-フィーダー層の1,4 としてマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs) 媒体を含む.MEFs 有糸分裂不活化された ES 細胞を培養する前に料理で育った事前.MEFs は、マウス ES 細胞接着と伝播を促進し、FBS は不可欠な栄養因子と細胞増殖のホルモンを提供しています5分化を抑制する成長因子の生成をサポートします。その後の研究は、LIF フィーダー細胞によって産生された自己複製とマウス ES 細胞の多能性維持のためのキーのサイトカインと培地へ添加 LIF フィーダー細胞6の代わりに示されます。現在、FBS/LIF 中の餌箱にマウス ES 細胞の維持はまだ多くの研究者によって採用された標準的な方法です。しかし、この古典文化のアプローチをいくつかの問題が発生します。まず、フィーダー細胞は過剰と制御されていない要因を分泌して7病原汚染を引き起こす可能性があります。血清含有 LIF 添加ゼラチンで料理の表面をコーティング、この干渉を避けるために媒体がフィーダー層セルを持たないマウスの ES 細胞を維持するための代替方法です。さらに、血清/LIF 条件下で栽培したマウス ES 細胞は、細胞集団とも8多能性関連因子の発現レベル形態学的多様性を示します。最近の研究は血清/LIF の条件下で (SOX2, Nanog、OCT4 など) コアの多能性関連転写因子は LIF と WNT シグナル伝達; 多能性を維持できるお勧めただし、特に、彼らもアクティブに分化8をトリガーする線維芽細胞成長因子 (FGF) 信号。コア転写因子のどっちつかずのデュアル アクションによるマウス ES 細胞無血清培養は ICM およびプライミング胚盤葉上層の状態8に似た別に類似した 2 つの交換可能な集団から成るの不均一性を提示します。また、血清中マウス ES 細胞はしばしばグローバル領域のメチル化9を展示する一方、ICM と PGCs の多能性9,10と密接にリンクされているグローバル hypomethylated 状態で。
マウスの ES 細胞を培養するための新しい方法を開発するかなりの需要があります。200311以降いくつか改良されたプロトコルが確立されているが、いくつかの制限事項と短所7が継続します。PD0325901 の 2 つ・小分子キナーゼ阻害剤の結合された使用率、2008 年以来 (マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) の阻害剤/細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) (MEK)) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素の阻害剤キナーゼ 3 (GSK3)) の培養マウス ES 細胞12N2B27 LIF と血清中が新たな視点を開いたが。この新しい定義された媒体は、2 つの阻害剤 (2 i) の使用によって特徴付けられます。2i/LIF 培地で培養したマウス ES 細胞より均一な細胞集団で多能性因子の発現。加えて、2i LIF 培養したマウス ES 細胞示す DNA 低いメチル化グローバル、ICM のような細胞9,13に近づいています。それでも、2i 文化は、その欠点を持っています。PD0325901 と CHIR99021 が水で溶けるとジメチルスルホキシド (DMSO) で一般に溶解している-ベースの培地でそれらを追加するストック ソリューション。研究は長期的なことを示したが、DMSO にセルの低線量の露出が細胞毒性14につながることができます。
ここでは、我々 は 2 つの低分子化合物を利用、マウス ES 細胞の新しい培養法を開発。新規培養法は、Vc、MEK 阻害剤 PD0325901 DNA 低いメチル化を急速に促進するためを結合し、効果的に Vc/PD0325901 培養プロトコルとして名前を PGC の対等なレベルに。マウス ES 細胞血清含有培地の Vc/PD0325901 追加の形態で均一性を展示し、基底状態の持続します。2i 文化と比較して、Vc/PD0325901 条件下で培養したマウス ES 細胞は DNA 脱メチル化の高速動力学を展示し、PGC に匹敵する低いメチル化レベルに到達することができます。さらに、単一の阻害剤 (PD0325901) の使用減少と比較して 2 i で使用中に DMSO の投入量 (PD0325901/CHIR99021) と細胞へのダメージを軽減。
Protocol
Representative Results
Discussion
仕事で行った Vc と PD0325901 未分化と hypomethylated 州は、Vc によって DNA 脱メチル化を促進し、 de novo DNA の抑制の相乗作用によって達成されたマウスの ES 細胞を維持するために組み合わせるの手法PD0325901 によるメチル化。また、マウスの ES 細胞は、Vc/PD0325901 文化システムの下で偉大な形態を示した。
良い Vc/PD0325901 培養系におけるマウス ES 細胞の状態を維持、いく…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、国家自然科学基金、中国の (21435008、h. w. に 21327006) と中国の科学アカデミーの戦略的な重点研究課題によって支持された (h. w. を XDB14030200)。
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
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