Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Pilhas do ES são originadas do ICM de um blastocisto¹. As células estão em um estado de pluripotência e podem formar todas as linhagens somáticas e de células da linha germinal². Estabelecimento de células ES fornece a oportunidade de investigar o desenvolvimento processa-se em vitro e pode gerar células de relevância médica para medicina regenerativa, com base na sua pluripotência³.

Dois grupos seminally estabeleceram as linhas de células de rato ES em 1981 e em células derivadas do embrião de rato foram cultivadas em soro fetal bovino (FBS)-contendo meio com fibroblastos embrionários de rato (MEFs) como o alimentador camada^1,4 . MEFs foram inactivados mitotically e pre-foram cultivadas em pratos antes de cultivo de células ES. MEFs fornecem suporte para fixação de células de rato ES e produzir fatores de crescimento para promover a propagação e reprimir a diferenciação⁵, enquanto FBS oferece essenciais fatores tróficos e hormônios para proliferação celular. Estudos posteriores indicaram que LIF produzido pelas células do alimentador foi o cytokine chave para autorenovação e manutenção da pluripotência em células de rato ES, pode substituir a adição de LIF no meio de alimentador células⁶. Atualmente, a sustentação do rato de pilhas do ES no meio de FBS/LIF em alimentadores ainda é o método padrão adotado por muitos pesquisadores. No entanto, alguns problemas surgem com esta abordagem da cultura clássica. Em primeiro lugar, alimentador células secretam fatores excessiva e descontroladas… e podem causar contaminação patogénica⁷. Para evitar esta interferência, revestir a superfície dos pratos com gelatina e a adição de LIF em soro contendo médio são métodos alternativos para a manutenção de células de rato ES sem células alimentador-camada. Além disso, células de rato ES cultivadas sob condições de soro/LIF apresentam heterogeneidade morfológica em populações de células e mesmo no nível de expressão de fatores relacionados a pluripotência⁸. Estudos recentes sugerem que, em condições de soro/LIF, os fatores de transcrição do núcleo pluripotência relacionados (incluindo OCT4, SOX2 e Nanog) podem sustentar a pluripotência através de LIF e WNT sinalização; no entanto, nomeadamente, eles também ativar um sinal de (FGF) do fator de crescimento fibroblástico para desencadear a diferenciação⁸. Devido à ação dupla ambivalente os núcleo de factores de transcrição, o rato ES células cultivadas no soro apresentam heterogeneidade, consistindo de duas populações intercambiáveis, um semelhante ao ICM e outro parecido com o epiblasto aprontada estado⁸. Além disso, as células de rato ES no soro muitas vezes apresentam hypermethylation global⁹, Considerando que ICM e PGCs estão em um estado de hypomethylated global, que está intimamente ligado com sua pluripotência^9,10.

Há uma demanda considerável para desenvolver novos métodos de cultivo de células de rato ES. Foram estabelecidos vários protocolos melhorados desde 2003¹¹ mas continua a haver algumas limitações e deficiências⁷. Desde 2008, a utilização combinada de dois inibidores da quinase da pequeno-molécula, PD0325901 (inibidor de quinase da proteína mitogen-ativado (MAPK) / extracelular-sinal-regulada quinase (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (inibidor de glicogénio sintase quinase 3 (GSK3)), em N₂B₂₇ médio com LIF e sem soro, abriu novas perspectivas para células de rato cultivo ES¹². Este novo meio definido é caracterizado pelo uso de dois inibidores (2i). ES de mouse células cultivadas em meio de 2i/LIF são mais homogêneas em populações de células e a expressão de fatores de pluripotência. Além disso, pilhas do rato 2i/LIF-cultivadas ES apresentam DNA hypomethylation globalmente, que está mais perto de células ICM^9,13. Mesmo assim, a cultura de 2i tem suas desvantagens. PD0325901 e CHIR99021 são insolúveis em água e geralmente dissolvem-se em dimetilsulfóxido (DMSO)-com base em solução para adicioná-los em meio de cultura. Estudos mostram que a longo prazo e baixa dose de exposição das células ao DMSO pode levar a citotoxicidade¹⁴.

Aqui, utilizamos dois compostos da pequeno-molécula e desenvolveu um novo método de cultura de células de rato ES. O método de cultura novela combina Vc e MEK inibidor PD0325901 para promover o DNA hypomethylation rapidamente e eficazmente a um nível comparável de PGC, nomeado como o protocolo de cultivo Vc/PD0325901. Pilhas do mouse ES em Vc/PD0325901-adicionado meio contendo soro apresentam homogeneidade na morfologia e são sustentadas em um estado fundamental. Comparado a cultura 2i, cultivadas sob condições de Vc/PD0325901 de pilhas do rato ES exibem cinética mais rápida da demetilação do ADN e podem atingir o nível de hypomethylation comparável do PGC. Além disso, o uso de um único inibidor (PD0325901) diminui a entrada quantidade de DMSO em média em comparação com que usado em 2i (PD0325901/CHIR99021) e reduz os danos às células.