Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Células madre embrionarias se originan del ICM de un blastocisto¹. Las células están en un estado de pluripotencia y pueden formar todos los linajes somáticos y del germline las células². Creación de células madre embrionarias ofrece la oportunidad de investigar el desarrollo de procesos en vitro y puede generar células de importancia médica para la medicina regenerativa basada en su pluripotencia³.

Establecido dos grupos seminally las líneas de células ES de ratón en 1981 y cuando las células derivadas del embrión temprano de ratón fueron cultivadas en suero fetal bovino (FBS)-que contiene medio con fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) como el alimentador capa^1,4 . MEFs fueron inactivadas mitotically y crecieron los platos antes de cultivar células madre embrionarias. MEFs proporcionan soporte para el accesorio de células de ratón ES y producen factores de crecimiento para promover la propagación y reprimir la diferenciación⁵, mientras que FBS ofrece factores tróficos esenciales y hormonas para la proliferación celular. Estudios posteriores indicaron que LIF producido por las células de alimentador estaba de la citoquina clave para la auto renovación y mantenimiento de la pluripotencia en las células ES de ratón, y la adición de LIF en el medio podría sustituir células de alimentador⁶. En la actualidad, el mantenimiento de las células ES de ratón en medio de la FBS/LIF en alimentadores sigue siendo el método estándar adoptado por muchos investigadores. Sin embargo, algunos problemas con este enfoque de la cultura clásica. En primer lugar, alimentador células secretan factores exceso y sin control y pueden causar contaminación patógena⁷. Para evitar esta interferencia, cubriendo la superficie de los platos con gelatina y la adición de LIF en suero que contiene medio son métodos alternativos para mantener las células de ratón ES sin células de la capa de alimentador. Además, las células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de suero/LIF exhiben heterogeneidad morfológica en poblaciones de la célula e incluso en el nivel de expresión de factores relacionados con la pluripotencia⁸. Estudios recientes sugieren que bajo condiciones de suero/LIF, los factores de transcripción básicos relacionados con la pluripotencia (incluyendo OCT4, SOX2 y Nanog) pueden mantener la pluripotencialidad LIF y WNT de señalización; sin embargo, en particular, también activan una señal de fibroblastos factor de crecimiento (FGF) para activar la diferenciación⁸. Debido a la doble acción ambivalente de los factores de transcripción del núcleo, células ES de ratón cultivadas en suero presentan heterogeneidad, consistiendo en dos poblaciones intercambiables, uno similar al ICM y otro parecido al epiblasto preparado estado⁸. Por otra parte, las células de ratón ES en suero a menudo muestran hipermetilación global⁹, mientras que ICM y PGCs se encuentran en un estado de hypomethylated global, que está estrechamente vinculado con su pluripotencia^9,10.

Existe una demanda considerable para desarrollar nuevos métodos para el cultivo de células ES de ratón. Se han establecido varios protocolos mejorados desde 2003¹¹ pero sigue habiendo algunas limitaciones y defectos⁷. Desde 2008, la utilización combinada de dos inhibidores de la cinasa de molécula pequeña, PD0325901 (inhibidor de la cinasa de proteína activada por mitógeno (MAPK) / extracelular regulada por señal quinasa (ERK) (MEK)) y CHIR99021 (el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3)), en N₂B₂₇ medio con LIF y sin suero ha abierto nuevas perspectivas para células de ratón cultivo ES¹². Este nuevo medio definido se caracteriza por el uso de dos inhibidores (2i). Las células ES de ratón cultivadas en medio 2i/LIF son más homogéneas en poblaciones celulares y la expresión de factores de pluripotencia. Además, las células de ratón 2i/LIF-cultivadas ES objeto expuesto hypomethylation de la DNA a nivel mundial, que está más cerca de ICM-como las células^9,13. Aún así, la cultura 2i tiene sus desventajas. PD0325901 y CHIR99021 son insolubles en agua y generalmente se disuelven en dimetil sulfóxido (DMSO)-basado en la solución para añadir en medio de cultivo. Los estudios han demostrado a largo plazo y dosis bajas de exposición de las células a DMSO puede llevar a citotoxicidad¹⁴.

Aquí, utilizamos dos compuestos de moléculas pequeñas y desarrolló un nuevo método de cultivo de células ES de ratón. El método de cultivo novela combina Vc y MEK inhibidor PD0325901 para promover el hypomethylation de la DNA rápidamente y con eficacia a un nivel comparable de PGC, nombrado como el protocolo de cultivo de Vc/PD0325901. Células ES de ratón en Vc/PD0325901-agregado que contiene el suero medio exhiben homogeneidad en morfología y se mantienen en un estado de tierra. En comparación con cultura de 2i, células ES de ratón cultivadas bajo condiciones de Vc/PD0325901 exhiben cinética más rápida de la desmetilación del ADN y pueden alcanzar el nivel de la hipometilación comparable a la del PGC. Además, el uso de un único inhibidor (PD0325901) disminuye la cantidad de entrada de DMSO en medio en comparación con la utilizada en 2i (PD0325901/CHIR99021) y reduce el daño a las células.