Un metodo di cultura alternativa per mantenere l'ipometilazione genomica delle cellule staminali embrionali del Mouse utilizzando PD0325901 inibitore MEK e vitamina C
Summary
Abbiamo descritto in dettaglio due protocolli basati su sostanze chimiche per la coltura di cellule staminali embrionali di topo. Questo nuovo metodo utilizza meccanismi sinergici di promuovere ossidazione Tet-mediata (da vitamina C) e reprimendo la sintesi de novo di 5-metilcitosina (da PD0325901) per mantenere l’ipometilazione del DNA e la pluripotenza delle cellule staminali embrionali di topo.
Abstract
Cellule staminali embrionali (ES) hanno la capacità di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre strati germinali (ectoderma, mesoderma o endoderma) e possono generare molti lignaggi per la medicina rigenerativa. ES cella cultura in vitro è stata a lungo oggetto di diffuse preoccupazioni. Classicamente, le cellule di topo ES sono mantenute in fattore inibitorio di leucemia e del siero (LIF)-che contiene il media. Tuttavia, in condizioni di siero/LIF, cellule mostrano eterogeneità nella morfologia e il profilo di espressione di geni correlati alla pluripotenza e sono per lo più in uno stato metastabile. Inoltre, cellule ES coltivate presentano ipermetilazione globale, ma ingenuo ES le cellule della massa cellulare interna (ICM) e cellule germinali primordiali (PGC) sono in uno stato di hypomethylation globale. Lo stato di ipometilato di ICM e PGC è associato molto attentamente con loro pluripotenza. Per migliorare i metodi di coltura cellulare di topo ES, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo metodo basato sull’utilizzazione selettivamente combinata di due composti di piccole molecole per mantenere lo stato di DNA ipometilato e pluripotenti. Qui, vi presentiamo che il co-trattamento di vitamina C (Vc) e PD0325901 può cancellare circa il 90% di 5-metilcitosina (5mC) a 5 giorni in cellule di topo ES. Il contenuto generato 5mC è paragonabile a quella di PGC. L’indagine meccanicistica dimostra che PD0325901 in su-regola l’espressione di Prdm14 per sopprimere Dnmt3b (de novo del DNA metiltransferasi) e Dnmt3l (il cofattore di Dnmt3b), riducendo la sintesi de novo del 5mC. VC facilita la conversione di 5mC a 5-idrossimetilcitosina (5hmC) catalizzata principalmente da Tet1 e Tet2, indicante la partecipazione di demethylations di DNA sia passive che attive. Inoltre, in condizioni di Vc/PD0325901, cellule di topo ES mostrano morfologia omogenea e stato pluripotent. Collettivamente, vi proponiamo un nuovo e metodo di cultura chimica-sinergia per il raggiungimento ipometilazione del DNA e mantenimento della pluripotenza in cellule di topo ES. Il metodo chimico-dipendente della piccolo-molecola sormonta le imperfezioni più importanti della cultura del siero e detiene promessa per generare cellule ES omogenee per ulteriori applicazioni cliniche e ricerche.
Introduction
Le cellule ES sono originate da ICM di una blastocisti1. Le cellule sono in uno stato di pluripotenza e possono formare tutti i lignaggi somatici e germinale celle2. Istituzione di cellule ES fornisce la possibilità di indagare lo sviluppo processi in vitro e in grado di generare cellule di rilevanza medica per la medicina rigenerativa basata sul loro pluripotenza3.
Due gruppi intaccata stabilito le linee di cellule di topo ES nel 1981 e quando le cellule derivate dal primo embrione di topo sono state coltivate in siero bovino fetale (FBS)-che contiene il media con fibroblasti embrionali del mouse (MEFs) come l’alimentatore livello1,4 . MEFs sono state inattivate mitoticamente e pre-sono stati coltivati in piatti prima della coltura delle cellule ES. MEFs forniscono il supporto per il collegamento delle cellule di topo ES e produrre fattori di crescita per promuovere la propagazione e reprimere la differenziazione5, mentre FBS offre essenziali fattori trofici e ormoni per proliferazione delle cellule. Studi successivi indicava che LIF prodotto da cellule di alimentatore la citochina chiave per auto-rinnovamento e mantenimento della pluripotenza in cellule di topo ES, e l’aggiunta di LIF nel mezzo potrebbe sostituire alimentatore celle6. Attualmente, il sostentamento delle cellule di ES del topo nel mezzo di FBS/LIF sugli alimentatori è ancora il metodo standard adottato da molti ricercatori. Tuttavia, alcuni problemi con questo approccio di cultura classica. In primo luogo, le cellule di alimentatore secernono fattori in eccesso e incontrollati e possono causare contaminazione patogena7. Per evitare questa interferenza, rivestimento della superficie dei piatti con gelatina e l’aggiunta di LIF in contenenti siero medio sono metodi alternativi per il mantenimento di cellule di topo ES senza cellule strato dell’alimentatore. Inoltre, cellule di topo ES coltivate in condizioni di siero/LIF esibiscono eterogeneità morfologica in popolazioni cellulari e anche a livello di espressione di fattori correlati al pluripotenza8. Gli studi recenti suggeriscono che in condizioni di siero/LIF, i fattori di trascrizione di nucleo di pluripotenza-correlati (tra cui SOX2, Nanog e OCT4) possono sostenere la pluripotenza attraverso LIF e WNT segnalazione; Tuttavia, in particolare, si attiva anche un segnale del fattore di crescita (FGF) del fibroblasto per attivare differenziazione8. Dovuto la duplice azione ambivalente dei fattori di trascrizione di nucleo, cellule di topo ES coltivate in siero attualmente eterogeneità, che consiste di due popolazioni intercambiabili, uno simile a ICM e un altro che assomiglia l’epiblasto innescato statale8. Inoltre, cellule di topo ES in siero esibiscono spesso globale ipermetilazione9, considerando che ICM e PGC sono in uno stato di ipometilato globale, che è strettamente collegato con la loro pluripotenza9,10.
C’è una forte domanda di sviluppare nuovi metodi per la coltura di cellule di topo ES. Diversi protocolli di miglioramento sono state istituite dal 200311 ma continua ad esserci alcune limitazioni e carenze7. Dal 2008, l’utilizzo combinato di due inibitori della chinasi della piccolo-molecola, PD0325901 (l’inibitore della chinasi di proteina mitogene-attivata (MAPK) / extracellulare-segnale-regolata della chinasi (ERK) (MEK)) e CHIR99021 (l’inibitore della glicogeno sintasi chinasi 3 (GSK3)), N2B27 medium con LIF e senza siero ha aperto nuove prospettive per coltura mouse ES cellule12. Questo nuovo medium definito è caratterizzato dall’uso di due inibitori (2i). Cellule di topo ES coltivate in medium 2i/LIF sono più omogenee in popolazioni di cellule e l’espressione dei fattori di pluripotenza. Inoltre, cellule 2i/LIF-coltivati del topo ES esibiscono ipometilazione del DNA a livello globale, che è più vicino a ICM-come le cellule9,13. Anche così, 2i cultura ha i suoi svantaggi. PD0325901 e CHIR99021 sono insolubili in acqua e generalmente sono dissolti in dimetilsolfossido (DMSO)-basato soluzione di riserva per aggiungerli nel terreno di coltura. Studi hanno dimostrato che a lungo termine e della basso-dose esposizione delle cellule a DMSO può portare a citotossicità14.
Qui, abbiamo utilizzato due composti di piccole molecole e sviluppato un nuovo metodo di coltura delle cellule di topo ES. Il metodo di cultura romanzo combina Vc e MEK inibitore PD0325901 per promuovere l’ipometilazione del DNA rapidamente e in modo efficace ad un livello paragonabile di PGC, denominato come il protocollo di coltura Vc/PD0325901. Cellule di topo ES in Vc/PD0325901-aggiunto medium contenente siero esibiscono omogeneità nella morfologia e sono sostenute in uno stato di terra. Rispetto alla cultura 2i, mouse ES cellule coltivate in condizioni di Vc/PD0325901 mostrano più veloce cinetica di demetilazione del DNA e possono raggiungere il livello di hypomethylation paragonabile a quella di PGC. Inoltre, l’uso di un inibitore singolo (PD0325901) diminuisce la quantità di input di DMSO in mezzo rispetto a quella utilizzata in 2i (PD0325901/CHIR99021) e riduce il danno alle cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel lavoro, abbiamo dimostrato un metodo novello di combinando Vc e PD0325901 per sostenere le cellule di topo ES a uno stato indifferenziato e ipometilato, che è stato raggiunto da un’azione sinergica di promuovere la demetilazione del DNA di Vc e soppressione de novo del DNA metilazione di PD0325901. Inoltre, cellule di topo ES ha mostrato grande morfologia sotto il sistema di coltura Vc/PD0325901.
Per meglio sostenere lo stato di cellule di topo ES nel sistema Vc/PD0325901 cultura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Foundation Natural Science of China (21435008 e 21327006 di H.W.) e il programma di ricerca di priorità strategica dell’Accademia cinese delle scienze (XDB14030200 di H.W.).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
Riferimenti
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