Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Клетки ES возникли от ICM бластоциста¹. Клетки находятся в состоянии плюрипотентности и могут образовывать все соматические линий и микрофлорой клетки². Создание клеток ES обеспечивает возможность исследовать развитие процессов в пробирке и может генерировать клетки медицинской значимости для регенеративной медицины, основанной на их плюрипотентности³.

Seminally созданы две группы линий клетки мыши ES в 1981 году и когда клетки, полученные из раннего эмбриона мыши были культивировали в плода бычьим сывороточным (ФБС)-содержащих средний с мыши эмбриональных фибробластов (MEFs) как фидер слой^1,4 . MEFs были инактивированных mitotically и предварительно были выращены в блюда до культивирования клеток ES. MEFs обеспечивают поддержку для мыши ES клеток вложения и производят факторов роста для содействия распространению и подавления дифференциация⁵, в то время как FBS предлагает основные трофических факторов и гормоны для пролиферации клеток. Последующие исследования указали, что LIF, производимые клетки фидера был ключевых цитокинов для самообновления и поддержания плюрипотентности в ES клеток мыши, и добавлением LIF в среду может подменить фидер клетки⁶. В настоящее время самообеспечение мыши ES клеток в среде FBS/LIF на кормушки-прежнему стандартный метод, принятый многими исследователями. Однако с этим подходом классической культуры возникают некоторые проблемы. Во-первых фидер клетки секретируют избыток и неконтролируемых факторов и может вызвать загрязнение патогенными⁷. Чтобы избежать этого вмешательства, покрытие поверхности блюда с желатином и добавлением LIF в сыворотке содержащих среднего, альтернативные методы для поддержания клеток мыши ES без подачи слоя клеток. Кроме того клетки ES мыши, выращенной в условиях, сыворотка/LIF экспонат морфологическая гетерогенность популяции клеток и даже уровень экспрессии факторов, связанных с плюрипотентности⁸. Последние исследования показывают, что в сыворотке/LIF условиях, связанных с плюрипотентности основных факторов транскрипции (включая SOX2, Nanog и OCT4) могут поддерживать плюрипотентности через LIF и WNT сигнализации; Однако в частности, они также активировать фибробластов фактор роста (ФБП) сигнал для запуска дифференцировки⁸. Из-за двойственной двойного действия основных факторов транскрипции мыши ES клетки культивировали в сыворотке представляют неоднородность, состоящий из двух взаимозаменяемых популяций, один похож на ICM и другой похожий загрунтовать Эпибласт государства⁸. Кроме того мышь ES клеток в сыворотке крови часто exhibit глобальной hypermethylation⁹, тогда как ICM и PGCs находятся в состоянии глобального hypomethylated, который тесно связан с их плюрипотентности^9,10.

Существует значительный спрос для разработки новых методов для культивирования клеток мыши ES. С 2003 года¹¹ были созданы несколько более протоколов, но продолжает быть некоторые ограничения и недостатки⁷. С 2008 года, комбинированного использования двух малых молекул протеинкиназы ингибиторов, PD0325901 (ингибитор Митоген активации протеинкиназы (MAPK) / внеклеточных сигналов регулируемой киназы (Эрк) (МЭК)) и CHIR99021 (ингибитора синтазы гликогена Киназа 3 (GSK3)), в N₂B₂₇ средних с LIF и без сыворотки открыло новые перспективы для культивирования мыши ES клеток¹². Это новое средство определенных характеризуется использованием двух ингибиторов (2i). Мыши ES клетки культивировали в среде 2i/LIF более однородны в клеточных популяций и выражение плюрипотентности факторов. Кроме того клетки мыши 2i/LIF-культивированный ES экспонат ДНК hypomethylation глобально, который ближе к ICM-подобных клеток^9,13. Несмотря на это 2i культура имеет свои недостатки. PD0325901 и CHIR99021 нерастворимы в воде и как правило, растворяются в диметилсульфоксида (ДМСО)-на основе фондовых решение, чтобы добавить их в питательную среду. Исследования показали, что долгосрочный и воздействия низких доз клеток ДМСО может привести к цитотоксичность¹⁴.

Здесь, мы использовали две небольшие молекулы соединений и разработали новый метод культуры клеток мыши ES. Роман культуры метод сочетает ингибитор PD0325901 Vc и MEK содействовать ДНК hypomethylation быстро и эффективно на сопоставимый уровень PGC, названный как Vc/PD0325901 культивирования протокола. Мышь ES клеток в среде Vc/PD0325901-добавлена сыворотки содержащих экспонат однородности в морфологии и выдержаны в первом состоянии. По сравнению с 2i культуры, мыши ES клетки культивировали в условиях Vc/PD0325901 выставку быстрее кинетика ДНК деметилирования и может достичь уровня hypomethylation, сопоставимую с PGC. Кроме того, использование одного ингибитора (PD0325901) уменьшает ввода ДМСО в среду по сравнению с используемой в 2i (PD0325901/CHIR99021) и уменьшает повреждения клеток.