שיטת תרבות חלופית כדי לשמור על Hypomethylation גנומית של תאי גזע עובריים בעכבר באמצעות MEK מעכב PD0325901 וויטמין C
Summary
אנחנו מתוארות בפרוטרוט שני פרוטוקולים המבוססות על חומרים כימיים עבור culturing בתאי גזע עובריים בעכבר. שיטה חדשה מנצל מנגנונים סינרגטי של קידום חמצון בתיווך טט (על-ידי ויטמין C) ומדכא דה נובו סינתזה של 5-methylcytosine (על-ידי PD0325901) כדי לשמור על ה-DNA hypomethylation pluripotency של תאי גזע עובריים בעכבר.
Abstract
תאי גזע עובריים (ES) יש את היכולת להבדיל בין לכל אחת משלוש שכבות הנבט (האנדודרם, והמזודרם או האאקטודרם), ניתן להפיק שושלות רבות עבור רפואה רגנרטיבית. ES תא תרבות במבחנה כבר זמן רב בנושא חששות נרחבת. באופן קלאסי, העכבר ES תאים נשמרים בסרום ו לוקמיה מעכבות פקטור (LIF)-המכיל בינוני. עם זאת, בתנאים סרום/LIF, תאים להראות הטרוגניות מורפולוגיה, לפרופיל ביטוי של גנים הקשורים pluripotency, בעיקר במצב והשלמת. יתר על כן, בתרבית תאים ES התערוכה הכללית hypermethylation, אך נאיבי ES תאים של התא הפנימי מסה (ICM), בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) במצב של hypomethylation העולמית. מדינת hypomethylated ICM, PGCs קשורה קשר הדוק pluripotency שלהם. כדי לשפר את העכבר ES תא תרבות שיטות, לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה המבוססת על ניצול סלקטיבי משולב של שתי תרכובות מולקולה קטנה כדי לשמור על המדינה hypomethylated ו pluripotent הדנ א. כאן, אנו מציגים את הטיפול שיתוף של ויטמין C (Vc), PD0325901 יכול למחוק כ 90% 5-methylcytosine (5mC) ב 5 ימים העכבר ES תאים. התוכן שנוצר 5mC דומה לזו של PGCs. החקירה מכניסטית מראה כי PD0325901 up-מווסת את הביטוי Prdm14 לדכא את Dnmt3b (de novo דנ א methyltransferase), Dnmt3l (קופקטור של Dnmt3b), על-ידי הפחתת סינתזה 5mC de novo . Vc מקלה את ההמרה של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) בעיקר על ידי Tet1, Tet2, המציין את מעורבותם של demethylations ה-DNA פסיביים ואקטיביים. יתר על כן, בתנאים Vc/PD0325901, העכבר ES תאים מראים pluripotent המדינה ומורפולוגיה הומוגנית. באופן קולקטיבי, אנו מציעים הרומן ושיטת כימית-סינרגיה תרבות להשגת DNA hypomethylation ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים. השיטה תלויי-כימית מולקולה קטנה מתגבר את החסרונות העיקריים של התרבות סרום, מביאות הבטחה לייצר הומוגניות תאים ES עבור יישומים קליניים נוספים מחקרים.
Introduction
ES תאים שמקורם את ICM של הבלסטוציסט1. התאים נמצאים במצב pluripotency והוא יכול ליצור כל שושלות הסומטית, תאים germline2. הקמת תאים ES מספק ההזדמנות לחקור את ההתפתחות תהליכי במבחנה ניתן להפיק תאים של הרלוונטיות רפואי עבור רפואה רגנרטיבית בהתבסס על שלהם pluripotency3.
שתי קבוצות seminally נוסדה הקווים תא העכבר ES בשנת 1981, כאשר תאים שמקורם העובר העכבר בתחילת היו תרבותי בנסיוב שור עוברית (FBS)-המכיל בינוני עם העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs) מזין שכבה1,4 . MEFs היו לא פעיל mitotically, גדלו מראש במנות לפני culturing תאים ES. MEFs מספקים תמיכה עבור העכבר ES תא מצורף ומפיקים גורמי גדילה כדי לקדם את הפצת ותרסן את הבידול5, בעוד FBS מציעה גורמים עם מחלות חיוניות והורמונים עבור התפשטות תאים. מחקרים מאוחרים יותר ציין כי LIF המיוצר על ידי תאי מזין היה ציטוקין מפתח התחדשות עצמית ותחזוקה של pluripotency העכבר ES תאים, התוספת של LIF לתוך האמצעי יכול תחליף מזין תאים6. כיום, התפרסות של העכבר ES התאים FBS/LIF בינוני-מזיני הוא עדיין השיטה הרגילה שאומצה על ידי חוקרים רבים. עם זאת, כמה בעיות עולות מתוך תפיסה זו התרבות הקלאסית. ראשית, מזין התאים מפרישים גורמי עודף בלתי מבוקרת, עלול לגרום זיהום פתוגניים7. כדי למנוע הפרעה זו, ציפוי המשטח של מנות עם ג’לטין ותוספת של LIF בסרום המכיל בינוני הן שיטות אלטרנטיביות לשמירה על העכבר ES תאים ללא תאים בשכבה מזין. בנוסף, העכבר ES התאים גדלו בתנאים סרום/LIF התערוכה מורפולוגי הטרוגניות אוכלוסיית תאים, אפילו ברמת הביטוי של גורמים הקשורים pluripotency8. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי בתנאים סרום/LIF, גורמי שעתוק הקשורות pluripotency הליבה (כולל SOX2, Nanog ו- OCT4) יכול לקיים את pluripotency דרך LIF ונ ט איתות; עם זאת, ראוי לציין, הם גם מפעילים אות פיברובלסט גורם הגדילה (FGF) כדי לעורר בידול8. עקב פעולה כפולה אמביוולנטי גורמי שעתוק הליבה, העכבר ES תאים בתרבית בנסיוב מציגים הטרוגניות, בהיקף של שתי האוכלוסיות להחלפה, אחד דומה ICM ועוד הדומה המדינה כאשר הבחינה epiblast8. יתר על כן, העכבר ES תאים בנסיוב לעתים קרובות להפגין hypermethylation העולמי9, בעוד ICM ו- PGCs הם במצב hypomethylated הכללית, אשר קשורה קשר הדוק שלהם9,pluripotency10.
יש ביקוש רב לפתח שיטות חדשות culturing העכבר ES תאים. מספר פרוטוקולים משופרת הוקמו מאז 200311 אבל שם ממשיך להיות כמה מגבלות, חסרונות7. מאז 2008, ניצול בשילוב של שני מעכבי קינאז מולקולה קטנה, PD0325901 (החומר המדכא של חלבון mitogen מופעל (MAPK) / חוץ-תאית-אות-מוסדר קינאז (טיפשה) (MEK)), CHIR99021 (המדכא של גליקוגן סינתאז קינאז 3 (GSK3)), N2ב’27 בינוני עם LIF ובלי סרום פתחה אופקים חדשים עבור culturing העכבר ES תאים12. בינוני מוגדר החדש מאופיין על ידי שימוש שני מעכבי (2i). העכבר ES התאים תרבותי במדיום 2i/LIF הם הומוגנית אוכלוסיות התאים ואת הביטוי של גורמים pluripotency. בנוסף, העכבר 2i/LIF-תרבותי ‘ ES תאים התערוכה DNA hypomethylation ברחבי העולם, אשר קרובה יותר תאים דמויי ICM9,13. למרות זאת, תרבות 2i יש החסרונות. PD0325901, CHIR99021 אינם מסיסים במים, בדרך כלל הם מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-מבוסס מניות פתרון כדי להוסיף אותם תרבות בינוני. מחקרים הראו כי לטווח ארוך, חשיפה במינון נמוך של תאים דימתיל סולפוקסיד יכול להוביל cytotoxicity14.
כאן, אנחנו מנוצל שתי תרכובות מולקולה קטנה פיתחה שיטה תרבות חדשה של העכבר ES תאים. שיטת תרבות הרומן משלב Vc מעכב MEK PD0325901 כדי לקדם את ה-DNA hypomethylation במהירות, ביעילות לרמה המקבילה של PGC, בשם פרוטוקול culturing Vc/PD0325901. העכבר ES התאים Vc/PD0325901-נוסף בינוני המכילים סרום התערוכה עניי מורפולוגיה, מתקיימים במצב הקרקע. בהשוואה ל- 2i תרבות, העכבר ES התאים תרבותי בתנאים Vc/PD0325901 שהפגינו קינטיקה מהירה יותר של ה-DNA demethylation, יכול להגיע לרמה hypomethylation לזו של PGC. בנוסף, השימוש מעכב יחיד (PD0325901) מפחית את כמות דימתיל סולפוקסיד. קלט לתוך בינוני בהשוואה בשימוש 2i (PD0325901/CHIR99021) ומפחית את הנזק לתאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה, הפגנו שיטה של שילוב Vc, PD0325901 כדי לקיים את העכבר ES תאים על מצב מובחן ו hypomethylated, אשר הושגה על ידי פעולה סינרגטי של קידום DNA demethylation מאת Vc ודיכוי דה נובו דנ א מתילציה על-ידי PD0325901. יתר על כן, העכבר ES התאים הראו מורפולוגיה נהדר תחת מערכת התרבות Vc/PD0325901.
לקיים יותר של המדינה ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (21435008 ו- 21327006 ל ה. ו), התוכנית האסטרטגית של מחקר עדיפות של האקדמיה הסינית למדעים (XDB14030200 ל ה. ו).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
Riferimenti
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17, 435-462 (2001).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev.Biol. 52 (4), 353-363 (2008).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
- Tamm, C., Galitó, S. P., Annerén, C. A comparative study of protocols for mouse embryonic stem cell culturing. Plos One. 8 (12), e81156 (2013).
- Yamaji, M. PRDM14 ensures naive pluripotency through dual regulation of signaling and epigenetic pathways in mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 368-382 (2013).
- Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
- Smith, Z. D., et al. A unique regulatory phase of DNA methylation in the early mammalian embryo. Nature. 484 (7394), 339-344 (2012).
- Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, I., Smith, A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell. 115 (3), 281-292 (2003).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Leitch, H. G., et al. Naive pluripotency is associated with global DNA hypomethylation. Nat. Struct. Mol. Biol. 20 (3), 311-316 (2013).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Yin, R., et al. Ascorbic acid enhances Tet-mediated 5-methylcytosine oxidation and promotes DNA demethylation in mammals. J. Am. Chem. Soc. 135 (28), 10396-10403 (2013).
- Guerra, A. D., Rose, W. E., Hematti, P., Kao, W. J. Minocycline modulates NFκB phosphorylation and enhances antimicrobial activity against Staphylococcus aureus in mesenchymal stromal/stem cells. Stem Cell Res. Ther. 8 (1), 171 (2017).
- Blaschke, K., et al. Vitamin C induces Tet-dependent DNA demethylation and a blastocyst-like state in ES cells. Nature. 500 (7461), 222-226 (2013).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- Wu, H., Zhang, Y. Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5-methylcytosine oxidation. Genes Dev. 25 (23), 2436-2452 (2011).
- Inoue, A., Zhang, Y. Replication-dependent loss of 5-hydroxymethylcytosine in mouse preimplantation embryos. Science. 334 (6053), 194 (2011).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Maiti, A., Drohat, A. C. Thymine DNA glycosylase can rapidly excise 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine: Potential implications for active demethylation of CpG sites. J. Biol. Chem. 286 (41), 35334-35338 (2011).
- Habibi, E., et al. Whole-genome bisulfite sequencing of two distinct interconvertible DNA methylomes of mouse embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (3), 360-369 (2013).
- von Meyenn, F., et al. Impairment of DNA methylation maintenance is the main cause of global demethylation in naive embryonic stem cells. Mol. Cell. 62, 848-861 (2016).
- Li, C., Liu, B., Zhong, S., Wang, H. MEK inhibitor PD0325901 and vitamin C synergistically induce hypomethylation of mouse embryonic stem cells. Oncotarget. 7 (26), 39730-39739 (2016).
- Hackett, J. A., et al. Synergistic mechanisms of DNA demethylation during transition to ground-state pluripotency. Stem Cell Reports. 1 (6), 518-531 (2013).
- Nakaki, F., Saitou, M. PRDM14: a unique regulator for pluripotency and epigenetic reprogramming. Trends Biochem. Sci. 39 (6), 289-298 (2014).
- Nichols, J., Smith, A. Pluripotency in the embryo and in culture. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4 (8), (2012).
