Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste¹. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales². Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence³.

Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le support avec les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) que le chargeur couche^1,4 . MEFs étaient inactivés mitose et ont été préalablement cultivées dans les plats avant mise en culture des cellules ES. MEFs appuient à la fixation des cellules ES de souris et produisent des facteurs de croissance pour promouvoir la propagation et de réprimer la différenciation⁵, tandis que le FBS propose des facteurs trophiques essentiels et hormones pour la prolifération cellulaire. Des études subséquentes indiquent que FRV produite par des cellules nourricières était la cytokine clée pour l’auto-renouvellement et l’entretien de pluripotence dans les cellules ES de souris, et l’addition de FRV dans le milieu pourrait remplacer alimentation cellules⁶. Actuellement, le maintien des cellules ES de souris dans un milieu FBS/FRV sur mangeoires est toujours la méthode standard adoptée par de nombreux chercheurs. Cependant, quelques problèmes avec cette approche de la culture classique. Tout d’abord, des cellules nourricières sécrètent des facteurs excessives et incontrôlées et peuvent causer la contamination pathogène⁷. Pour éviter cette ingérence, revêtement de la surface des plats avec de la gélatine et l’ajout de FRV dans contenant du sérum moyen sont des méthodes alternatives pour maintenir les cellules de souris ES sans cellules de la couche de conducteur. En outre, les cellules d’ES de souris cultivées dans des conditions de sérum/FRV pièce hétérogénéité morphologique dans les populations de cellules et même dans le niveau d’expression de facteurs liés à la pluripotence⁸. Des études récentes suggèrent que, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, les facteurs de transcription de base liées à la pluripotence (y compris OCT4, SOX2 et Nanog) peuvent maintenir la pluripotence FRV et WNT signaling ; Cependant, en particulier, ils activent également un signal de facteur de croissance (FGF) de fibroblastes pour déclencher la différenciation⁸. En raison de la double action ambivalente, les base de facteurs de transcription, souris ES cellules cultivées dans le sérum présentes hétérogénéité, composé de deux sous-groupes interchangeables, un semblable à l’ICM et une autre qui ressemble à l’épiblaste apprêtée état⁸. En outre, les cellules de souris ES dans le sérum présentent souvent hyperméthylation global⁹, tandis que ICM et PGC est dans un état de hypométhylés global, qui est étroitement lié à leur pluripotence^9,10.

Il y a une demande considérable pour développer de nouvelles méthodes de culture de cellules de souris ES. Plusieurs protocoles améliorés ont été établis depuis 2003¹¹ , mais il y a encore quelques limitations et défauts⁷. Depuis 2008, l’utilisation combinée des deux inhibiteurs de la kinase de petites molécules, PD0325901 (l’inhibiteur de la protéine mitogène-kinase (MAPK) / extracellulaire-signal-regulated kinase ERK (MEK)) et CHIR99021 (l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK3)), en N₂B₂₇ milieu avec FRV et sans sérum a ouvert des nouvelles perspectives culture souris ES cellules¹². Ce nouveau milieu défini est caractérisé par l’utilisation de deux inhibiteurs (2i). Les cellules ES de souris cultivées dans un milieu 2i/FRV sont plus homogènes dans les populations de cellules et l’expression des facteurs de pluripotence. En outre, des cellules de souris cultivées 2i/FRV ES pièce hypométhylation de l’ADN dans le monde, qui est plus proche de cellules ICM^9,13. Malgré cela, la culture 2i a ses inconvénients. PD0325901 et CHIR99021 sont insolubles dans l’eau sont généralement dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)-base de solution mère pour les ajouter dans le milieu de culture. Des études ont montré qu’à long terme et exposition de faible dose de cellules à DMSO peut conduire à la cytotoxicité¹⁴.

Ici, nous avons utilisé deux composés de petites molécules et mis au point une nouvelle méthode de culture de cellules de souris ES. La méthode de culture originale allie Vc et MEK inhibiteur PD0325901 pour promouvoir l’hypométhylation de l’ADN rapidement et efficacement à un niveau comparable de PGC, nommé comme le protocole de culture Vc/PD0325901. Les cellules de souris ES dans Vc/PD0325901-ajout d’un milieu contenant du sérum pièce homogénéité morphologique et sont maintenues dans un état fondamental. Par rapport à la culture de 2i, cellules ES de souris cultivées dans des conditions de Vc/PD0325901 pièce cinétique rapide de déméthylation de l’ADN et peuvent atteindre le niveau de l’hypométhylation comparable à celle du PGC. En outre, l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) diminue la quantité d’entrée de DMSO en moyenne par rapport à celle utilisée dans la 2i (PD0325901/CHIR99021) et réduit les dommages aux cellules.