Eine Alternative Kultur-Methode, um genomische Hypomethylierung von embryonalen Stammzellen der Maus mit MEK-Inhibitor PD0325901 und Vitamin C aufrechtzuerhalten
Summary
Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ES) haben das Potenzial, sich in eines der drei mikrobeschichten (Entoderm, Mesoderm und Ektoderm) differenzieren und erzeugen viele Linien für die regenerative Medizin. ES Zelle Kultur in Vitro seit langem Gegenstand weit verbreitete Bedenken. Klassisch, Maus-ES-Zellen in Serum und Leukämie hemmenden Faktor (LIF) gepflegt werden-Medium enthält. Allerdings Bedingungen Serum/LIF Zellen zeigen Heterogenität in Morphologie und das Expressionsprofil von Pluripotenz-Genen und sind meist in einem metastabilen Zustand. Darüber hinaus kultivierte ES-Zellen zeigen globale Hypermethylation, aber naiv ES-Zellen der inneren Zellmasse (ICM) und primordialen Keimzellen (PGCs) sind in einem Zustand der globalen Hypomethylierung. Der hypomethyliert Zustand des ICM und PGCs ist eng verbunden mit ihrer Pluripotenz. Zur Verbesserung der Maus-ES Zelle Kulturmethoden entwickelten wir vor kurzem eine neue Methode basiert auf der gezielt kombinierte Nutzung von zwei kleine Molekül-Verbindungen, die DNA-hypomethyliert und pluripotenten Zustand zu halten. Hier präsentieren wir die Mitbehandlung von Vitamin C (Vc) und PD0325901 können etwa 90 % der 5-Methylcytosine (5mC) an 5 Tagen in ES-Zellen löschen. Der generierte 5mC Inhalt ist vergleichbar mit dem in PGCs. Die mechanistische Untersuchung zeigt, dass PD0325901 bis Prdm14 Ausdruck Dnmt3b unterdrücken regelt (de Novo DNA-Methyltransferase) und Dnmt3l (der Cofaktor von Dnmt3b), durch die Reduzierung 5mC- de-Novo -Synthese. VC erleichtert die Umstellung der 5mC auf 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysiert hauptsächlich durch Tet1 und Tet2, zeigt die Einbindung der passiven und aktiven DNA-Demethylations. Darüber hinaus zeigen ES-Zellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen, homogene Morphologie und pluripotenten Zustand. Gemeinsam schlagen wir eine neuartige und Chemikalie-Synergie-Kultur-Methode für DNA-Hypomethylierung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Maus-ES-Zellen zu erreichen. Die kleine Molekül chemisch-abhängige Methode überwindet die größten Schwächen der Serum-Kultur und hält Versprechen, homogene Embryonaler Stammzellen für weitere klinische Anwendungen und Forschungen zu generieren.
Introduction
ES-Zellen stammen vom ICM einer Blastozyste1. Die Zellen sind in einem Zustand der Pluripotenz und alle somatischen Abstammungen und Germline Zellen2bilden können. Einrichtung von ES-Zellen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung zu untersuchen in-vitro- Verfahren und medizinische Relevanz für die regenerative Medizin, basierend auf ihre Pluripotenz3Zellen zu generieren.
Zwei Gruppen seminally der Maus-ES-Zell-Linien im Jahr 1981 gegründet und wenn Zellen aus der frühen Maus-Embryo im fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert wurden-mit Medium mit Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Layer1,4 . MEFs mitotically inaktiviert wurden und wurden bereits in Gerichte vor der Kultivierung Embryonaler Stammzellen angebaut. MEFs bieten Unterstützung für Maus-ES Zellhaftung und produzieren Wachstumsfaktoren zur Förderung der Verbreitung und der Differenzierung5, zu unterdrücken, während FBS wesentliche trophische Faktoren und Hormone für die Zellproliferation bietet. Nachfolgende Studien gezeigt, dass LIF von Feeder-Zellen produziert die wichtigen Zytokin für Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in ES-Zellen wurde, und die Zugabe von LIF in das Medium Feeder Zellen6ersetzen könnte. Derzeit ist die Erhaltung der Maus-ES-Zellen in FBS/LIF Medium Feeder noch die standard-Methode von vielen Forschern angenommen. Ergeben sich jedoch einige Probleme mit diesem Ansatz der klassischen Kultur. Erstens, Feeder-Zellen sezernieren übermäßige und unkontrollierte Faktoren und pathogenen Verunreinigungen7verursachen. Zur Vermeidung von dieser Interferenzen, Beschichtung der Oberfläche der Gerichte mit Gelatine und die Zugabe von LIF in Serum-haltigen Medium sind alternative Methoden für die Aufrechterhaltung der Maus-ES-Zellen ohne Feeder-Schicht Zellen. Zusätzlich, zeigen ES-Zellen unter Serum/LIF Bedingungen gewachsen morphologische Heterogenität in Zell-Populationen und sogar in die Expression von Pluripotenz-bezogene Faktoren8. Neuere Studien legen nahe, dass Serum/LIF Bedingungen der Pluripotenz-bezogene Kern Transkriptionsfaktoren (einschließlich OCT4, SOX2 und Nanog) der Pluripotenz durch LIF und WNT signalisieren aufrecht erhalten können; Bemerkenswert ist, aktivieren sie jedoch auch ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Signal an Differenzierung8auslösen. Aufgrund der ambivalente duale Wirkung von den Kern-Transkriptionsfaktoren präsentieren ES-Zellen kultiviert im Serum Heterogenität, bestehend aus zwei austauschbare Populationen, eine ähnlich ICM und anderen ähnlich grundiert Epiblast Stand8. Darüber hinaus weisen Maus-ES-Zellen im Serum häufig global Hypermethylation9, während ICM und PGCs in einem globalen hypomethyliert Zustand sind, die eng mit ihrer Pluripotenz9,10.
Es gibt eine hohe Nachfrage, neue Methoden zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen entwickeln. Einige verbesserte Protokolle wurden seit 200311 aber weiterhin einige Einschränkungen und Mängel7. Seit 2008, die kombinierte Nutzung von zwei kleinen Molekül-Kinase-Inhibitoren, PD0325901 (der Inhibitor der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) / extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) (MEK)) und CHIR99021 (der Inhibitor der Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3)), in N2B27 Medium mit LIF und ohne Serum hat eröffnet neue Perspektiven für Maus-Kultivierung ES12Zellen. Dieses neue definierte Medium zeichnet sich durch die Verwendung von zwei Inhibitoren (2i). Maus Embryonische Stammzellen in 2i/LIF Medium kultiviert sind homogener in Zell-Populationen und der Ausdruck der Pluripotenz Faktoren. Darüber hinaus weisen 2i/LIF-kultivierte Maus-ES-Zellen DNA-Hypomethylierung weltweit, welche kommt ICM-wie Zellen9,13. 2i Kultur hat auch so seine Nachteile. PD0325901 und CHIR99021 sind unlöslich in Wasser und in der Regel aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)-basierte Stammlösung in Kulturmedium hinzuzufügen. Studien haben gezeigt, dass langfristige und niedrig dosierte Belastung von Zellen mit DMSO zu Zytotoxizität14führen kann.
Hier haben wir zwei kleine Molekül-Verbindungen genutzt und eine neue Kultur-Methode von Maus-ES-Zellen entwickelt. Die neue Kultur-Methode kombiniert Vc und MEK-Inhibitor PD0325901 zur Förderung der DNA-Hypomethylierung schnell und effektiv auf ein vergleichbares Niveau der PGC, benannt als Vc/PD0325901 Kultivierung Protokoll. Maus Embryonische Stammzellen in Vc/PD0325901-added Serum-haltigen Medium Homogenität in der Morphologie aufweisen und sind in einem Grundzustand nachhaltig. Im Vergleich zu 2i Kultur, Maus Embryonische Stammzellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen kultiviert weisen schnellere Kinetik der DNA Demethylierung und erreichen die Hypomethylierung Ebene von PGC vergleichbar. Darüber hinaus verringert sich die Verwendung einer einzigen Hemmstoff (PD0325901) der eingangsbetrag von DMSO in Medium im Vergleich zu dem in 2i verwendet (PD0325901/CHIR99021) und reduziert den Schaden auf Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der Arbeit haben wir eine neuartige Methode der Kombination von Vc und PD0325901 um Maus-ES-Zellen in einem undifferenzierten und hypomethyliert Zustand aufrecht zu erhalten, die durch eine synergistische Wirkung der Förderung der DNA Demethylierung von Vc und unterdrücken de Novo DNA erreicht wurde gezeigt. Methylierung von PD0325901. Darüber hinaus zeigte ES-Zellen große Morphologie unter dem Vc/PD0325901-Kultur-System.
Um besser den Zustand der Maus-ES-Zellen in das Vc/PD032…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (21435008 und 21327006, h.w.) und die strategische Priorität Forschungsprogramm von der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB14030200, HW).
Materials
| fetal bovine serum Australia source | Corning | 35-076-CV | Component of mouse ES cell medium |
| DMEM/high glucose | Hyclone | SH30022 | Component of mouse ES cell medium |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Component of mouse ES cell medium |
| non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140050 | Component of mouse ES cell medium |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Component of mouse ES cell medium |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | Component of mouse ES cell medium |
| penicillin streptomycin solution | Gibco | 15140122 | Component of mouse ES cell medium |
| PBS | Sigma | P5493 | Cells rinse |
| trypsin | Hyclone | SH30042 | Cell dissociation |
| gelatin | Sigma | 48722 | Dishes coating |
| PD0325901 | Stemolecule | 04-0006-10 | small-molecule chemical for cell culture |
| CHIR99021 | Stemolecule | 04-0004 | small-molecule chemical for cell culture |
| vitamin C | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | XW00508171 | small-molecule chemical for cell culture |
| Ultra Bioscience water purification systemr | Purelab | Ultra | Ultra water |
| DMSO | Sigma | D8418 | Cell freezing medium |
| centrifuger | Eppendorf | 5427R | DNA and protein extraction |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | Component of RIPA buffer |
| PMSF Protease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 36978 | Component of RIPA buffer |
| DTT | Sigma | 43815 | Component of RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E3889 | Component of RIPA buffer |
| Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 | Genomic DNA extraction |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | NanoDrop 2000 | Determination of DNA concentration |
| calf intestinal phosphatase | New England Biolabs | M0290 | DNA digestion |
| DNase I | New England Biolabs | M0303 | DNA digestion |
| snake venom phosphodiesterase I | Sigma | P4506 | DNA digestion |
| Nanosep 3K Omega | Pall | OD003C35 | filtration of digested DNA |
| 1290 UHPLC system | Agilent | 1290 | UHPLC separation |
| G6410B triple quadrupole mass spectrometer | Agilent | G6410B | MS/MS analysis |
| Zorbax Eclipse Plus C18 column | Agilent | Zorbax Eclipse Plus | colume for UHPLC separation |
| 5-methylcytosine | Solarbio Life Sciences | SM8900 | standard 5mC |
| 5-hydroxymethylcytosine (standard) | Toronto Research Chemicals | M295900 | standard 5hmC |
| Prdm14 antibody | bioworld | BS7634 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3a antibody | bioworld | BS6587 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3b antibody | abcam | ab13604 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt3l antibody | abcam | ab3493 | Western blot analysis-primary antibody |
| Dnmt1 antibody | abcam | ab13537 | Western blot analysis-primary antibody |
| β-tubulin antibody | bioworld | BS1482MH | Western blot analysis-primary antibody |
| goat anti-rabbit IgG | abcam | ab6721 | Western blot analysis-secondary antibody |
| goat anti-mouse IgG | abcam | ab6789 | Western blot analysis-secondary antibody |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | RNA extraction |
| reverse transcription system | Promega | A3500 | RNA reverse transcription |
| GoTaq qPCR Master Mix | Promega | A6001 | RT-PCR |
| StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kit | Cells Biolabs, Inc. | CBA-302 | alkaline phosphatase staining analysis |
| mouse ES cells: WT, 129 SvEv | Provided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China) | cell strain of mouse ES cells | |
| microscope | Zeiss | LSM510 | cells observation |
| GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Prism Software Inc. | 5.0 | statistical analysis |
Riferimenti
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