Kuyruk Damarı Enjeksiyonu: Fare Modelinde Metastatik Çalışmalar için Kanser Hücrelerini Uygulama Yöntemi

1. Etiketli kanser hücrelerinin kuyruk damarı enjeksiyonu

NOT: Adım 1.2.4, singeneik BALB / c farelerde büyüyen 4T1 hücreleri için optimize edilmiştir. Diğer kanser hücre çizgileri ve fare suşları kullanılırsa, enjekte edilen hücre sayısı ve tahlil uzunluğu öncelikle optimize edilmelidir.

1. 2. adımda oluşturulan 4T1 hücre hatlarını tam büyüme ortamlarında iki adet 15 cm'lik tabakta genişletin, böylece enjeksiyon gününde fazla hücreler kullanılabilir.
2. Hücreleri kuyruk damarı enjeksiyonu için aşağıdaki gibi hazırlayın:
   1. Ortamı aspire edin ve hücre plakalarını 1x PBS ile durulayın.
   2. Hücreleri 15 cm plaka başına 5 mL tripsin ile 2-5 dakika boyunca deneyin (hücreler kuyunun dibinden serbestçe durulanmalıdır). Tüm hücreleri konik bir tüpe aktarın. Doku kültürü çanaktan kalan hücreleri tripsinleri söndürmek için yeterli tam büyüme ortamıyla yıkayın ve yıkamayı aynı konik tüpe ekleyin.
   3. Toplam hücre numarasını belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
   4. Hücreleri 122 x g'da 3 dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı epire edin ve hücreleri istenen konsantrasyonda 1x PBS'de yeniden biriktirin. Burada, her fareye 100 μL PBS'de 2,5 x 10⁴ hücre enjekte edilir, böylece hücreler 2,5 x 10⁵ hücre /mL'de yeniden ıslanır. Hücre süspansiyonlarını enjeksiyona kadar buzda tutun.
      NOT: Hücrelerin trypsinizasyonu ile kuyruk damarı enjeksiyonu arasındaki süreyi kabaca 1 saat ile sınırlamak önemlidir.
3. 1.2.5. adımdan 4T1 hücrelerini aşağıdaki gibi yanal kuyruk damarı aracılığıyla farelere enjekte edin:
   1. Hayvan tesisinde bir başlıkta çalışarak, tüpü ters çevirerek veya düzgün bir şekilde yeniden depolandıklarından emin olmak için 1 mL şırınna kullanarak hücreleri hafifçe ama iyice karıştırın. Şırınnayı yüklemeden önce her zaman hücrelerin yeniden biriktirilmesini sağlayın.
   2. Hücre süspansiyonu ile 1 mL Luer-lock şırınna yükleyin ve fazla hava kabarcıklarını dışarı atın. Şırınganın üzerine eğimli 1/2 inç, 30 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve hava kabarcıklarını dışarı atın.
   3. Fareyi yavaşça bir kemirgen kısıtlayıcıya yerleştirin.
   4. Yanal kuyruk damarları görünür ve genişlemiş olmalıdır. Değilse, kuyruğun tabanını hafifçe kıstırın ve damarları genişletmek için kuyruğu ılık musluk suyuna batırın.
      NOT: Damarların genişlemesi, fare kafesini bir ısıtma lambasının altına ve/veya bir ısıtma yastığının üzerine yerleştirerek de elde edilebilir.
   5. Kuyruğu temizlemek için alkol mendili kullanın. İğneyi kuyruk damarına yerleştirin, eğimli tarafı yukarı ve 100 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
      NOT: İğne damar içine düzgün bir şekilde yerleştirilirse, kolayca hafifçe ileri ve arkaya kaymalı ve piston itildiğinde direnç olmamalıdır. Başarılı enjeksiyonlar ayrıca, damarın mavi renginin enjeksiyondan sonra birkaç saniye beyaza döndüğü bir "floş" ile sonuçlanmalıdır.
4. İğneyi yavaşça çıkarın ve steril bir gazlı bez kullanarak, kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.
5. Fareyi kafesine geri döndürün ve tam iyileşmeyi sağlamak için 15 dakika izleyin. Fareler haftada 3 kat ağrı veya sıkıntı belirtileri açısından kontrol edilmelidir.
6. Bir in vivo canlı hayvan görüntüleme cihazı kullanarak fareleri 3-6 hafta boyunca metastaz oluşumu ve büyümesi için izleyin (bkz. adımlar 1.5 ve 1.6).