Elucidando #946;-1,3-glucanasa y peroxidasa, propiedades fisicoquímicas del mecanismo de defensa de la pared celular del trigo contra la infestación por Diuraphis noxia
Summary
El presente protocolo describe los procedimientos utilizados para estudiar y caracterizar las enzimas relacionadas con la pared celular, principalmente la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa, en plantas de trigo. Sus niveles de actividad aumentan durante la interacción trigo-RWA y están involucrados en la respuesta de defensa de la planta a través del refuerzo de la pared celular, lo que disuade la alimentación de pulgones.
Abstract
Las plantas de trigo infestadas por pulgones rusos del trigo (RWA) inducen una cascada de respuestas de defensa, incluidas las respuestas de hipersensibilidad (HR) y la inducción de proteínas relacionadas con la patogénesis (PR), como la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa (POD). Este estudio tiene como objetivo caracterizar las propiedades fisicoquímicas de la POD y la β-1,3-glucanasa asociadas a la pared celular y determinar su sinergia en la modificación de la pared celular durante la interacción RWASA2-trigo. Los cultivares Tugela susceptible, Tugela-Dn1 moderadamente resistente y Tugela-Dn5 resistente se pregerminaron y plantaron en condiciones de invernadero, se fertilizaron 14 días después de la siembra y se regaron cada 3 días. Las plantas se infestaron con 20 individuos partenogenéticos del mismo clon RWASA2 en la etapa de 3 hojas, y las hojas se cosecharon de 1 a 14 días después de la infestación. El fluido de lavado intercelular (IWF) se extrajo mediante filtración al vacío y se almacenó a -20 °C. Los residuos de las hojas se trituraron hasta convertirlos en polvo y se utilizaron para los componentes de la pared celular. La actividad y caracterización de POD se determinó utilizando sustrato de guayacol 5 mM yH2O2, monitoreando el cambio en la absorbancia a 470 nm. La actividad de la β-1,3-glucanasa, el pH y las condiciones óptimas de temperatura se demostraron midiendo los azúcares reductores totales en el hidrolizado con reactivo DNS utilizando sustratos de β-1,3-glucano y β-1,3-1,4-glucano, midiendo la absorbancia a 540 nm y utilizando la curva estándar de glucosa. El pH óptimo se determinó entre pH 4 a 9, la temperatura óptima entre 25 y 50 °C y la estabilidad térmica entre 30 °C y 70 °C. La especificidad del sustrato de β-1,3-glucanasa se determinó a 25 °C y 40 °C utilizando sustratos de curdlan y cebada β-1,3-1,4-glucano. Además, se determinó el modo de acción de la β-1,3-glucanasa utilizando laminaribiosa a laminaripentaosa. Los patrones de productos de hidrólisis de oligosacáridos se analizaron cualitativamente con cromatografía en capa fina (TLC) y cuantitativamente con HPLC. El método presentado en este estudio demuestra un enfoque robusto para infestar trigo con RWA, extrayendo peroxidasa y β-1,3-glucanasa de la región de la pared celular y su caracterización bioquímica integral.
Introduction
Los pulgones rusos del trigo (APR) infestan el trigo y la cebada, causando una pérdida significativa de rendimiento o una reducción de la calidad del grano. El trigo responde a la infestación induciendo varias respuestas de defensa, incluyendo el aumento de los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa y la peroxidasa en los cultivares resistentes, mientras que los cultivares susceptibles reducen la actividad de estas enzimas en el período de infestación temprano 1,2,3,4. Las funciones clave de la β-1,3-glucanasa y la POD en la planta de trigo incluyeron la regulación de la acumulación de calosa en el cultivar resistente y el enfriamiento de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en la pared celular y las regiones apoplásticas durante la infestación por RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 demostraron que había una fuerte correlación entre el aumento de la actividad de POD y el aumento del contenido de lignina en el cultivar de trigo resistente tras las infestaciones de RWASA2. Además, el aumento del contenido de lignina indicó que la pared celular del cultivar de trigo resistente infestado se reforzó, lo que llevó a una reducción de la alimentación con RWA.
La mayoría de los grupos de investigación extrajeron y estudiaron la β-1,3-glucanasa apoplástica y la POD durante la interacción trigo/cebada-RWA; además, la mayoría de estos estudios afirmaron que estas enzimas influyen en la pared celular de la planta de trigo infestada con RWA sin medir la presencia de la enzima en la región de la pared celular. Solo unos pocos estudios han utilizado técnicas microscópicas para demostrar que los niveles de actividad de la β-1,3-glucanasa estaban relacionados con la regulación de la calosa 7,8,9 o han extraído los principales componentes de la pared celular para demostrar la correlación entre las actividades de POD y la modificación de la pared celular en los resistentes 6,10. La falta de sondeo de la asociación de la β-1,3-glucanasa y la POD con la pared celular indica la necesidad de desarrollar métodos que permitan a los investigadores medir directamente las enzimas unidas a la pared celular.
El método actual propone que es necesario eliminar el líquido apoplástico del tejido de la hoja antes de extraer las enzimas unidas a la pared celular. El procedimiento de extracción del líquido apoplástico debe realizarse dos veces del tejido de la hoja, que se utiliza para extraer las enzimas unidas a la pared celular. Este proceso reduce la contaminación y la confusión de las enzimas apoplásticas con las que se encuentran en las regiones de la pared celular. Por lo tanto, en este estudio, extrajimos POD unidos a la pared celular, β-1,3-glucanasa y β-glucanasa específicos de MLG y realizamos su caracterización bioquímica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trigo y la cebada son cultivos de cereales frecuentemente infestados por especies de pulgones, incluyendo el pulgón ruso del trigo (Diuraphis noxia)7,24. Las plantas de trigo resistentes inducen la regulación positiva de las actividades de POD y β-1,3-glucanasa como respuestas de defensa durante todo el período de infestación para modificar la pared celular mediante la regulación de la acumulación de calosa y lignina <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa recibió financiación de la NRF-Thuthuka (Nº de referencia: TTK2204102938). S.N. Zondo recibió la beca de posgrado de la Fundación Nacional de Investigación para su maestría. Los autores agradecen al Instituto del Consejo de Investigación Agrícola – Grano Pequeño (ARC-SG) por proporcionar las semillas utilizadas en este estudio. Todas las opiniones, hallazgos y recomendaciones expresadas en este material pertenecen a los autores y, por lo tanto, los financiadores no aceptan ninguna responsabilidad al respecto.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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