Aufklärung der physikalisch-chemischen Eigenschaften von #946;-1,3-Glucanase und Peroxidase des Abwehrmechanismus der Weizenzellwand gegen Diuraphis noxia-Befall
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von zellwandbezogenen Enzymen, hauptsächlich β-1,3-Glucanase und Peroxidase, in Weizenpflanzen. Ihr Aktivitätsniveau nimmt während der Weizen-RWA-Interaktion zu und ist an der pflanzlichen Abwehrreaktion durch Zellwandverstärkung beteiligt, die das Fressen von Blattläusen verhindert.
Abstract
Weizenpflanzen, die von Russischen Weizenblattläusen (RWA) befallen sind, induzieren eine Kaskade von Abwehrreaktionen, einschließlich der Überempfindlichkeitsreaktionen (HR) und der Induktion von pathogeneseverwandten (PR) Proteinen wie β-1,3-Glucanase und Peroxidase (POD). Ziel dieser Studie ist es, die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Zellwand-assoziiertem POD und β-1,3-Glucanase zu charakterisieren und ihren Synergismus auf die Zellwandmodifikation während der RWASA2-Weizen-Interaktion zu bestimmen. Die anfälligen Sorten Tugela, mäßig resistentes Tugela-Dn1 und resistentes Tugela-Dn5 wurden vorgekeimt und unter Gewächshausbedingungen gepflanzt, 14 Tage nach der Pflanzung gedüngt und alle 3 Tage bewässert. Die Pflanzen wurden im 3-Blatt-Stadium mit 20 parthenogenetischen Individuen desselben RWASA2-Klons befallen, und die Blätter wurden 1 bis 14 Tage nach dem Befall geerntet. Die Interzelluläre Waschflüssigkeit (IWF) wurde mittels Vakuumfiltration extrahiert und bei -20 °C gelagert. Blattreste wurden zu Pulver zerkleinert und für Zellwandbestandteile verwendet. Die POD-Aktivität und -Charakterisierung wurden unter Verwendung von 5 mM Guajakol Substrat und H2O2 bestimmt, wobei die Änderung der Absorption bei 470 nm überwacht wurde. β-1,3-Glucanase-Aktivität, pH-Wert und Temperatur optimale Bedingungen wurden durch Messung des gesamten reduzierenden Zuckers im Hydrolysat mit DNS-Reagenz unter Verwendung von β-1,3-Glucan- und β-1,3-1,4-Glucan-Substraten, Messung der Absorption bei 540 nm und unter Verwendung der Glukose-Standardkurve nachgewiesen. Das pH-Optimum wurde zwischen pH 4 und 9, das Temperaturoptimum zwischen 25 und 50 °C und die thermische Stabilität zwischen 30 °C und 70 °C bestimmt. Die Spezifität des β-1,3-Glucanase-Substrats wurde bei 25 °C und 40 °C unter Verwendung von Curdlan und Gerste β-1,3-1,4-Glucan-Substraten bestimmt. Zusätzlich wurde der Wirkmechanismus von β-1,3-Glucanase mittels Laminaribiose zu Laminaripentaose bestimmt. Die Muster der Oligosaccharidhydrolyseprodukte wurden qualitativ mit Dünnschichtchromatographie (DC) und quantitativ mit HPLC analysiert. Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode demonstriert einen robusten Ansatz für den Befall von Weizen mit RWA, die Extraktion von Peroxidase und β-1,3-Glucanase aus der Zellwandregion und deren umfassende biochemische Charakterisierung.
Introduction
Russische Weizenblattläuse (RWA) befallen Weizen und Gerste und verursachen erhebliche Ertragsverluste oder eine Verringerung der Getreidequalität. Weizen reagiert auf einen Befall, indem er verschiedene Abwehrreaktionen hervorruft, einschließlich der Erhöhung der β-1,3-Glucanase- und Peroxidase-Aktivität in den resistenten Sorten, während anfällige Sorten die Aktivität dieser Enzyme in der frühen Befallsphase verringern 1,2,3,4. Zu den Schlüsselfunktionen von β-1,3-Glucanase und POD in der Weizenpflanze gehörten die Regulierung der Callose-Akkumulation in der resistenten Sorte und der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), das Quenchen an der Zellwand und den apoplastischen Regionen während eines RWA-Befalls 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 zeigten, dass es eine starke Korrelation zwischen der erhöhten POD-Aktivität und dem erhöhten Ligningehalt in der resistenten Weizensorte bei RWASA2-Befall gab. Darüber hinaus deutete ein erhöhter Ligningehalt darauf hin, dass die Zellwand der befallenen resistenten Weizensorte verstärkt wurde, was zu einer reduzierten RWA-Fütterung führte.
Die meisten Forschergruppen extrahierten und untersuchten apoplastische β-1,3-Glucanase und POD während der Weizen/Gerste-RWA-Interaktion; Darüber hinaus behaupteten die meisten dieser Studien, dass diese Enzyme die Zellwand der mit RWA befallenen Weizenpflanze beeinflussen, ohne das Vorhandensein von Enzymen im Zellwandbereich zu messen. Nur wenige Studien haben mikroskopische Techniken verwendet, um zu zeigen, dass die β-1,3-Glucanase-Aktivität mit der Callose-Regulation verbunden ist 7,8,9 oder extrahierte wichtige Zellwandkomponenten, um die Korrelation zwischen POD-Aktivitäten und Zellwandmodifikation bei den resistenten 6,10 zu demonstrieren. Das Fehlen von Untersuchungen der Assoziation von β-1,3-Glucanase und POD mit der Zellwand deutet darauf hin, dass Methoden entwickelt werden müssen, die es den Forschern ermöglichen, die an die Zellwand gebundenen Enzyme direkt zu messen.
Die derzeitige Methode schlägt vor, dass die Entfernung der apoplastischen Flüssigkeit aus dem Blattgewebe notwendig ist, bevor die an die Zellwand gebundenen Enzyme extrahiert werden. Das Extraktionsverfahren der apoplastischen Flüssigkeit muss zweimal aus dem Blattgewebe durchgeführt werden, das zur Extraktion der an die Zellwand gebundenen Enzyme verwendet wird. Dieser Prozess reduziert die Kontamination und Verwechslung der apoplastischen Enzyme mit denen in den Zellwandregionen. Daher haben wir in dieser Studie zellwandgebundenes POD, β-1,3-Glucanase und MLG-spezifische β-Glucanase extrahiert und ihre biochemische Charakterisierung durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Weizen und Gerste sind Getreidepflanzen, die häufig von Blattlausarten befallen werden, zu denen auch die Russische Weizenblattlaus (Diuraphis noxia) gehört7,24. Resistente Weizenpflanzen induzieren die Hochregulierung von POD- und β-1,3-Glucanase-Aktivitäten als Abwehrreaktionen während der gesamten Befallsperiode, um die Zellwand zu modifizieren, indem sie die Akkumulation von Callose und Lignin regulieren<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa wurde von der NRF-Thuthuka finanziert (Referenznummer: TTK2204102938). S.N. Zondo erhielt das Postgraduiertenstipendium der National Research Foundation für seinen MSc-Abschluss. Die Autoren danken dem Agricultural Research Council – Small Grain (ARC-SG) Institute für die Bereitstellung des in dieser Studie verwendeten Saatguts. Alle Meinungen, Erkenntnisse und Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die des Autors/der Autoren, und daher übernehmen die Geldgeber diesbezüglich keine Haftung.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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