توضيح # 946 ؛ -1،3-الجلوكاناز والبيروكسيديز الخصائص الفيزيائية والكيميائية لآلية الدفاع عن جدار خلية القمح ضد الإصابة بالديورافيس نوكسيا
Summary
يصف هذا البروتوكول الإجراءات المستخدمة لدراسة وتوصيف الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية ، وخاصة β-1،3-glucanase و peroxidase ، في نباتات القمح. تزداد مستويات نشاطها أثناء تفاعل القمح و RWA وتشارك في استجابة دفاع النبات من خلال تعزيز جدار الخلية ، مما يردع تغذية المن.
Abstract
تحفز نباتات القمح الموبوءة بحشرات من القمح الروسي (RWA) سلسلة من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك الاستجابات شديدة الحساسية (HR) وتحريض البروتينات المرتبطة بالإمراض (PR) ، مثل β-1،3-glucanase و peroxidase (POD). تهدف هذه الدراسة إلى توصيف الخواص الفيزيائية والكيميائية لجدار الخلية المرتبطة ب POD و β-1،3-glucanase وتحديد تآزرها على تعديل جدار الخلية أثناء تفاعل RWASA2-wheat. تم إنبات أصناف Tugela-Dn1 الحساسة ، و Tugela-Dn1 المقاومة بشكل معتدل ، وأصناف Tugela-Dn5 المقاومة مسبقا وزرعها في ظروف الدفيئة ، وتم تخصيبها بعد 14 يوما من الزراعة ، وتم ريها كل 3 أيام. كانت النباتات موبوءة ب 20 فردا بارثينوجينيا من نفس استنساخ RWASA2 في مرحلة 3 أوراق ، وتم حصاد الأوراق في 1 إلى 14 يوما بعد الإصابة. تم استخراج سائل الغسيل بين الخلايا (IWF) باستخدام الترشيح الفراغي وتخزينه عند -20 درجة مئوية. تم سحق بقايا الأوراق إلى مسحوق واستخدامها لمكونات جدار الخلية. تم تحديد نشاط وتوصيف POD باستخدام ركيزة 5 mM guaiacol و H2O2 ، ومراقبة التغير في الامتصاص عند 470 نانومتر. تم إثبات نشاط β-1،3-glucanase ودرجة الحموضة والظروف المثلى لدرجة الحرارة من خلال قياس إجمالي السكريات المختزلة في التحلل المائي باستخدام كاشف DNS باستخدام ركائز β-1،3-glucan و β-1،3-1،4-glucan ، وقياس الامتصاص عند 540 نانومتر ، واستخدام منحنى الجلوكوز القياسي. تم تحديد الأس الهيدروجيني الأمثل بين الرقم الهيدروجيني 4 إلى 9 ، ودرجة الحرارة المثلى بين 25 و 50 درجة مئوية ، والاستقرار الحراري بين 30 درجة مئوية و 70 درجة مئوية. تم تحديد خصوصية ركيزة β-1،3-glucanase عند 25 درجة مئوية و 40 درجة مئوية باستخدام ركائز curdlan و barley β-1،3-1،4-glucan. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد طريقة عمل β-1،3-glucanase باستخدام laminaribiose إلى laminaripentaose. تم تحليل أنماط منتجات التحلل المائي قليل السكاريد نوعيا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) وتحليلها كميا باستخدام HPLC. توضح الطريقة المقدمة في هذه الدراسة نهجا قويا لغزو القمح ب RWA ، واستخراج البيروكسيديز و β-1،3-glucanase من منطقة جدار الخلية وتوصيفها الكيميائي الحيوي الشامل.
Introduction
تصيب حشرات من القمح الروسي (RWA) القمح والشعير ، مما يتسبب في خسارة كبيرة في المحصول أو انخفاض جودة الحبوب. يستجيب القمح للإصابة عن طريق إحداث العديد من الاستجابات الدفاعية ، بما في ذلك زيادة مستويات نشاط β-1،3-glucanase و peroxidase في الأصناف المقاومة ، بينما تقلل الأصناف الحساسة من نشاط هذه الإنزيمات في فترة الإصابة المبكرة1،2،3،4. تضمنت الوظائف الرئيسية ل β-1،3-glucanase و POD في نبات القمح تنظيم تراكم الكالوز في الصنف المقاوم وتبريد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في جدار الخلية والمناطق الأوسترية أثناء الإصابة ب RWA1،3،5،6،7. أظهر Mafa et al.6 أن هناك علاقة قوية بين زيادة نشاط POD وزيادة محتوى اللجنين في صنف القمح المقاوم عند الإصابة ب RWASA2. بالإضافة إلى ذلك ، تشير زيادة محتوى اللجنين إلى تعزيز الجدار الخلوي لصنف القمح المقاوم المصاب ، مما أدى إلى انخفاض تغذية RWA.
قامت معظم مجموعات الباحثين باستخراج ودراسة apoplastic β-1،3-glucanase و POD أثناء تفاعل القمح / الشعير – RWA. بالإضافة إلى ذلك ، ادعت معظم هذه الدراسات أن هذه الإنزيمات تؤثر على جدار الخلية في نبات القمح المصاب ب RWA دون قياس وجود الإنزيم في منطقة جدار الخلية. استخدمت دراسات قليلة فقط التقنيات المجهرية لإظهار أن مستويات نشاط β-1،3-glucanase كانت مرتبطة بتنظيم الكالوز7،8،9 أو استخرجت مكونات جدار الخلية الرئيسية لإثبات العلاقة بين أنشطة POD وتعديل جدار الخلية في المقاومة6،10. يشير عدم فحص ارتباط β-1،3-glucanase و POD بجدار الخلية إلى الحاجة إلى تطوير طرق تسمح للباحثين بقياس الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية مباشرة.
تقترح الطريقة الحالية أن إزالة السائل الأوسلجي من أنسجة الأوراق قبل استخراج الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية أمر ضروري. يجب إجراء عملية استخراج السائل apoplastic مرتين من أنسجة الأوراق ، والتي تستخدم لاستخراج الإنزيمات المرتبطة بجدار الخلية. تقلل هذه العملية من تلوث وارتباك الإنزيمات apoplastic مع تلك الموجودة في مناطق جدار الخلية. وهكذا ، في هذه الدراسة ، استخلصنا POD المرتبط بجدار الخلية ، β-1،3-glucanase ، و MLG الخاص ب β-glucanase وأجرينا توصيفها الكيميائي الحيوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
القمح والشعير من محاصيل الحبوب التي كثيرا ما تصيبها أنواع المن ، بما في ذلك حشرات من القمح الروسي (Diuraphis noxia)7,24. تحفز نباتات القمح المقاومة على تنظيم أنشطة POD و β-1،3-glucanase كاستجابات دفاعية طوال فترة الإصابة لتعديل جدار الخلية عن طريق تنظيم تراكم الكالوز و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى M. Mafa تمويلا من NRF-Thuthuka (الرقم المرجعي: TTK2204102938). حصل S.N. Zondo على منحة الدراسات العليا لمؤسسة البحوث الوطنية للحصول على درجة الماجستير. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمجلس البحوث الزراعية – معهد الحبوب الصغيرة (ARC-SG) لتوفير البذور المستخدمة في هذه الدراسة. أي رأي ونتائج وتوصيات معبر عنها في هذه المادة هي آراء المؤلف (المؤلفين) ، وبالتالي ، لا يتحمل الممولون أي مسؤولية فيما يتعلق بذلك.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
References
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
- Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
- Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
- Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
- Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
- Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
- Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
- Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
- Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
- Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
- Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
- Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
- Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
- Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
- Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
- Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
- Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
- . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
- Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
- Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
- Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
- Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
- Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
- Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
.