Chiarire le proprietà fisico-chimiche di #946;-1,3-glucanasi e perossidasi del meccanismo di difesa della parete cellulare del grano contro l'infestazione da Diuraphis noxia
Summary
Il presente protocollo descrive le procedure utilizzate per studiare e caratterizzare gli enzimi correlati alla parete cellulare, principalmente β-1,3-glucanasi e perossidasi, nelle piante di frumento. I loro livelli di attività aumentano durante l’interazione grano-RWA e sono coinvolti nella risposta di difesa delle piante attraverso il rinforzo della parete cellulare, che scoraggia l’alimentazione degli afidi.
Abstract
Le piante di grano infestate dagli afidi russi del grano (RWA) inducono una cascata di risposte di difesa, tra cui le risposte di ipersensibilità (HR) e l’induzione di proteine correlate alla patogenesi (PR), come la β-1,3-glucanasi e la perossidasi (POD). Questo studio mira a caratterizzare le proprietà fisico-chimiche della POD associata alla parete cellulare e della β-1,3-glucanasi e a determinare il loro sinergismo sulla modifica della parete cellulare durante l’interazione RWASA2-grano. Le cultivar Tugela-Dn1 e Tugela-Dn5 suscettibili, moderatamente resistenti sono state pregerminate e piantate in serra, fertilizzate 14 giorni dopo la semina e irrigate ogni 3 giorni. Le piante sono state infestate da 20 individui partenogenetici dello stesso clone RWASA2 allo stadio di 3 foglie e le foglie sono state raccolte da 1 a 14 giorni dopo l’infestazione. Il liquido di lavaggio intercellulare (IWF) è stato estratto mediante filtrazione sottovuoto e conservato a -20 °C. I residui fogliari sono stati frantumati in polvere e utilizzati per i componenti della parete cellulare. L’attività e la caratterizzazione del POD sono state determinate utilizzando 5 mM di substrato di guaiacolo e H2O2, monitorando la variazione dell’assorbanza a 470 nm. L’attività della β-1,3-glucanasi, il pH e le condizioni ottimali di temperatura sono stati dimostrati misurando gli zuccheri riducenti totali nell’idrolizzato con il reagente DNS utilizzando substrati di β-1,3-glucano e β-1,3-1,4-glucano, misurando l’assorbanza a 540 nm e utilizzando la curva standard del glucosio. Il pH ottimale è stato determinato tra pH 4 e 9, la temperatura ottimale tra 25 e 50 °C e la stabilità termica tra 30 °C e 70 °C. La specificità del substrato di β-1,3-glucanasi è stata determinata a 25 °C e 40 °C utilizzando substrati di cagliata e orzo β-1,3-1,4-glucano. Inoltre, la modalità d’azione della β-1,3-glucanasi è stata determinata utilizzando la laminaribiosio alla laminaripentasio. I modelli di prodotti dell’idrolisi degli oligosaccaridi sono stati analizzati qualitativamente con cromatografia su strato sottile (TLC) e analizzati quantitativamente con HPLC. Il metodo presentato in questo studio dimostra un approccio robusto per infestare il grano con RWA, estraendo la perossidasi e la β-1,3-glucanasi dalla regione della parete cellulare e la loro caratterizzazione biochimica completa.
Introduction
Gli afidi russi del grano (RWA) infestano il grano e l’orzo, causando una significativa perdita di resa o una riduzione della qualità del grano. Il frumento risponde all’infestazione inducendo diverse risposte di difesa, tra cui l’aumento dei livelli di attività della β-1,3-glucanasi e della perossidasi nelle cultivar resistenti, mentre le cultivar sensibili riducono l’attività di questi enzimi nel periodo di infestazione precoce 1,2,3,4. Le funzioni chiave della β-1,3-glucanasi e della POD nella pianta di frumento includevano la regolazione dell’accumulo di callosio nella cultivar resistente e l’estinzione delle specie reattive dell’ossigeno (ROS) sulla parete cellulare e sulle regioni apoplastiche durante l’infestazione da RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 hanno dimostrato che c’era una forte correlazione tra l’aumento dell’attività delle POD e l’aumento del contenuto di lignina nella cultivar di grano resistente in seguito a infestazioni da RWASA2. Inoltre, l’aumento del contenuto di lignina indicava che la parete cellulare della cultivar di grano resistente infestata era rinforzata, portando a una riduzione dell’alimentazione RWA.
La maggior parte dei gruppi di ricercatori ha estratto e studiato la β-1,3-glucanasi apoplastica e la POD durante l’interazione grano/orzo-RWA; inoltre, la maggior parte di questi studi ha affermato che questi enzimi influenzano la parete cellulare della pianta di grano infestata da RWA senza misurare la presenza dell’enzima nella regione della parete cellulare. Solo pochi studi hanno utilizzato tecniche microscopiche per dimostrare che i livelli di attività della β-1,3-glucanasi erano collegati alla regolazione del calcosio 7,8,9 o hanno estratto i principali componenti della parete cellulare per dimostrare la correlazione tra le attività del POD e la modifica della parete cellulare nel 6,10 resistente. La mancanza di sondare l’associazione β-1,3-glucanasi e POD alla parete cellulare indica la necessità di sviluppare metodi che consentano ai ricercatori di misurare direttamente gli enzimi legati alla parete cellulare.
Il metodo attuale propone che sia necessario rimuovere il fluido apoplastico dal tessuto fogliare prima di estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. La procedura di estrazione del liquido apoplastico deve essere eseguita due volte dal tessuto fogliare, che viene utilizzato per estrarre gli enzimi legati alla parete cellulare. Questo processo riduce la contaminazione e la confusione degli enzimi apoplastici con quelli che si trovano nelle regioni della parete cellulare. Pertanto, in questo studio, abbiamo estratto il POD legato alla parete cellulare, la β-1,3-glucanasi e la β-glucanasi specifica per MLG e abbiamo eseguito la loro caratterizzazione biochimica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il grano e l’orzo sono colture cerealicole frequentemente infestate da specie di afidi, tra cui gli afidi russi del grano (Diuraphis noxia)7,24. Le piante di grano resistenti inducono l’upregolazione delle attività della POD e della β-1,3-glucanasi come risposte di difesa durante il periodo di infestazione per modificare la parete cellulare regolando l’accumulo di calclosio e lignina 6,25,26,27…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa ha ricevuto finanziamenti dalla NRF-Thuthuka (numero di riferimento: TTK2204102938). S.N. Zondo ha ricevuto la borsa di studio post-laurea della National Research Foundation per il suo diploma di laurea magistrale. Gli autori sono grati all’Agricultural Research Council – Small Grain Institute (ARC-SG) per aver fornito i semi utilizzati in questo studio. Tutte le opinioni, i risultati e le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e, pertanto, i finanziatori non si assumono alcuna responsabilità al riguardo.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
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