Summary

#946;-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼのジ ウラフィス・ノキサ 病侵入に対するコムギ細胞壁防御機構の物理化学的性質の解明

Published: July 26, 2024
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Summary

本プロトコルは、コムギ植物における細胞壁関連酵素、主にβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼを研究し、特徴付けるために使用される手順を説明しています。それらの活性レベルは、コムギとRWAの相互作用中に増加し、アブラムシの摂食を阻止する細胞壁強化を通じて植物の防御応答に関与しています。

Abstract

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)に感染したコムギ植物は、過敏反応(HR)やβ-1,3-グルカナーゼやペルオキシダーゼ(POD)などの病原性関連(PR)タンパク質の誘導など、一連の防御応答を誘発します。この研究は、細胞壁関連PODとβ-1,3-グルカナーゼの物理化学的特性を特徴付け、RWASA2-小麦相互作用中の細胞壁修飾に対するそれらの相乗性を決定することを目的としています。感受性Tugela、中等度抵抗性のTugela-Dn1、および抵抗性Tugela-Dn5品種は、温室条件下で事前に発芽および植え付け、植え付け後14日で施肥し、3日ごとに灌漑しました。植物には、3葉の段階で同じRWASA2クローンの単為生殖個体20人が感染し、葉は寄生後1〜14日で収穫されました。細胞間洗浄液(IWF)を真空ろ過を用いて抽出し、-20°Cで保存した。 葉の残渣を粉砕して粉末にし、細胞壁成分に利用しました。PODの活性と特性評価は、5 mMのグアイアコール基質とH2O2を使用して決定され、470 nmでの吸光度の変化をモニタリングしました。β-1,3-グルカンおよびβ β-1,3-グルカン基質および-1,3-1,4-グルカン基質を用いたDNS試薬による加水分解物中の総還元糖の測定、540nmでの吸光度の測定、グルコース標準曲線を用いて、-1,3-グルカナーゼ活性、pH、および温度の最適条件を実証した。最適pHはpH 4〜9、最適温度は25〜50°C、熱安定性は30°C〜70°Cの間で決定されました。β-1,3-グルカナーゼ基質の特異性は、カードランおよび大麦β-1,3-1,4-グルカン基質を使用して、25°Cおよび40°Cで決定されました。さらに、β-1,3-グルカナーゼの作用機序は、ラミナリビオースからラミナリペンタオースまでを用いて決定されました。オリゴ糖加水分解生成物のパターンを薄層クロマトグラフィー(TLC)で定性的に分析し、HPLCで定量的に分析しました。この研究で提示された方法は、RWAを小麦に寄生させ、細胞壁領域からペルオキシダーゼとβ-1,3-グルカナーゼを抽出し、それらの包括的な生化学的特性評価を行うための堅牢なアプローチを示しています。

Introduction

ロシア産コムギアブラムシ(RWA)は、小麦や大麦に蔓延し、大幅な収量減少や穀物品質の低下を引き起こします。コムギは、耐性品種のβ-1,3-グルカナーゼおよびペルオキシダーゼ活性レベルを増加させるなど、いくつかの防御応答を誘発することにより蔓延に応答しますが、感受性品種は、初期の蔓延期間1,2,3,4でこれらの酵素の活性を低下させます。コムギ植物におけるβ-1,3-グルカナーゼとPODの主な機能には、抵抗性品種におけるカロース蓄積の調節と、RWAの蔓延中に細胞壁とアポプラスト領域で消光する活性酸素種(ROS)が含まれていました1,3,5,6,7。Mafaら6は、RWASA2の蔓延時に、耐性コムギ品種のPOD活性の増加とリグニン含有量の増加との間に強い相関関係があることを示しました。さらに、リグニン含有量の増加は、感染した抵抗性コムギ品種の細胞壁が強化され、RWAの摂食が減少したことを示しました。

ほとんどの研究者グループは、小麦/大麦-RWA相互作用中のアポプラストβ-1,3-グルカナーゼとPODを抽出して研究しました。さらに、これらの研究のほとんどは、これらの酵素が細胞壁領域での酵素の存在を測定することなく、RWAが蔓延した小麦植物の細胞壁に影響を与えると主張していました。顕微鏡技術を使用して、β-1,3-グルカナーゼ活性レベルがカロース調節に関連していることを示したり、耐性6,10のPOD活性と細胞壁修飾との相関関係を実証するために主要な細胞壁成分を抽出したりした研究はごくわずかです。β-1,3-グルカナーゼとPODの細胞壁との会合を調査できていないことは、研究者が細胞壁に結合した酵素を直接測定できる方法を開発する必要があることを示しています。

現在の方法では、細胞壁結合酵素を抽出する前に、葉組織からアポプラスティ液を除去することが必要であると提案されています。アポプラスチック液の抽出手順は、細胞壁結合酵素の抽出に使用される葉組織から2回実行する必要があります。このプロセスにより、アポプラスト酵素と細胞壁領域に見られる酵素との汚染と混同が減少します。そこで、本研究では、細胞壁に結合したPOD、β-1,3-グルカナーゼ、およびMLG特異的なβ-グルカナーゼを抽出し、それらの生化学的特性評価を行った。

Protocol

この研究は、フリーステート大学の環境およびバイオセーフティ研究倫理委員会(UFS-ESD2022/0131/22)の承認と許可を得て実施されました。ここに掲載されている試薬と機器の詳細は、 材料表に記載されています。 1.植物の成長条件 各小麦品種の250個の種子、すなわち、感受性ツゲラ、中等度耐性のトゥゲラ-Dn1、 および耐性ツゲラ-D…

Representative Results

コムギ品種の4つの生物学的複製物(Tugela、Tugela-Dn1、およびTugela-Dn5)は、3葉の成長段階でRWASA2に感染しました。蔓延後、葉は1、2、3、7、および14dpiで収穫されました。対照処理にはRWASA2が寄生していなかったため、実験結果はストレスにさらされていない小麦植物と同等になりました。実験は四重極で行われ、結果は平均値として提示されました。 RWASA2 に感?…

Discussion

小麦と大麦は、ロシアのコムギアブラムシ(Diuraphis noxia)7,24を含むアブラムシ種が頻繁に蔓延する穀物作物です。抵抗性コムギ植物は、カロースとリグニンの蓄積を調節することにより、細胞壁を修飾するために、蔓延期間を通じて防御応答としてPODおよびβ-1,3-グルカナーゼ活性のアップレギュレーションを誘導します</…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.マファはNRF-Thuthuka(参照番号:TTK2204102938)から資金提供を受けました。S.N. Zondoは、修士号を取得するために国立研究財団大学院奨学金を受け取りました。著者らは、この研究で使用された種子を提供してくれた農業研究評議会-小粒穀物(ARC-SG)研究所に感謝しています。この資料で表明された意見、調査結果、および推奨事項は著者のものであり、したがって、資金提供者はそれに関していかなる責任も負いません。

Materials

10 kDa Centrifuge concentrating membrane device Sigma-Aldrich R1NB84206 For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions.
2 g Laminaribiose Megazyme (Wicklow, Ireland) O-LAM2 High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3 g Laminaritriose Megazyme (Wicklow, Ireland) O-LAM3 High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
3,5 Dinitro salicylic acid Sigma-Aldrich D0550 Used in colorimetric determination of reducing sugars
4 g Laminaritetraose  Megazyme (Wicklow, Ireland) O-LAM4 High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
5 g Laminaripentaose Megazyme (Wicklow, Ireland) O-LAM5 High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis.
95% Absolute ethanol Sigma-Aldrich 107017 Ethanol absolute for analysis
acetic acid Sigma-Aldrich B00063 Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid)
Azo-CM-Cellulose Megazyme (Wicklow, Ireland) S-ACMC The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues.
Beta glucan (barley)  Megazyme (Wicklow, Ireland) G6513 A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity.
Bio-Rad Protein Assay Dye Bio-Rad Laboratories, South africa 500-0006 Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II 
Bovine serum albumin (BSA) Gibco Europe 810-1018 For Laboratory use only
Citrate acid Sigma-Aldrich C0759 For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
CM-curdlan  Megazyme (Wicklow, Ireland) P-CMCUR Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water.
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270 For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures.
Guaiacol Sigma-Aldrich G5502 Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity.
Hydrogen peroxide BDH Laboratory Supplies, England 10366 Powerful oxidising agent.
Mikskaar Professional Substarte Mikskaar (Estonia) NI Peat moss-based seedling substrate.
Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) Multifeed Classic B1908248 A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development.
Naphthol Merck, Germany N2780 Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst.
Phenol Sigma-Aldrich 33517 Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available
Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) Sigma-Aldrich S2377 used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar.
Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) Sigma-Aldrich 60778-25EA Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045 For R&D use only. Not for drug, household, or other uses.
Sodium metabisulfite Sigma-Aldrich 31448 Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions.
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S9390 Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant.
Sodium phosphate monobasic heptahydrate Sigma-Aldrich 71500 An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts.
Statistical analysis software TIBCO Statistica version 13.1
Sulfuric acid Merck, Darmstadt, Germany 30743 Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent.
Tris-HCl Sigma-Aldrich 10812846001 Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures.
UV–Visible Spectrophotometer GENESYS 120 
 NI = not identified.

References

  1. Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
  28. Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
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Zondo, S. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Elucidating #946;-1,3-Glucanase and Peroxidase Physicochemical Properties of Wheat Cell Wall Defense Mechanism Against Diuraphis noxia Infestation. J. Vis. Exp. (209), e66903, doi:10.3791/66903 (2024).

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