Diuraphis noxia İstilasına Karşı Buğday Hücre Duvarı Savunma Mekanizmasının #946;-1,3-Glukanaz ve Peroksidaz Fizikokimyasal Özelliklerinin Açıklanması
Summary
Mevcut protokol, buğday bitkilerinde başta β-1,3-glukanaz ve peroksidaz olmak üzere hücre duvarı ile ilgili enzimleri incelemek ve karakterize etmek için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır. Buğday-RWA etkileşimi sırasında aktivite seviyeleri artar ve yaprak biti beslenmesini caydıran hücre duvarı takviyesi yoluyla bitki savunma tepkisinde yer alır.
Abstract
Rus buğday yaprak bitleri (RWA) tarafından istila edilen buğday bitkileri, aşırı duyarlı tepkiler (HR) ve β-1,3-glukanaz ve peroksidaz (POD) gibi patogenezle ilgili (PR) proteinlerin indüksiyonu dahil olmak üzere bir dizi savunma tepkisine neden olur. Bu çalışma, hücre duvarı ile ilişkili POD ve β-1,3-glukanazın fizikokimyasal özelliklerini karakterize etmeyi ve RWASA2-buğday etkileşimi sırasında hücre duvarı modifikasyonu üzerindeki sinerjilerini belirlemeyi amaçlamaktadır. Duyarlı Tugela, orta derecede dayanıklı Tugela-Dn1 ve dayanıklı Tugela-Dn5 çeşitleri sera koşullarında önceden çimlendirilerek ekildi, ekimden 14 gün sonra gübrelendi ve her 3 günde bir sulandı. Bitkiler, 3 yapraklı aşamada aynı RWASA2 klonunun 20 partenogenetik bireyi ile istila edildi ve yapraklar istiladan 1 ila 14 gün sonra hasat edildi. Hücreler arası yıkama sıvısı (IWF), vakum filtrasyonu kullanılarak ekstrakte edildi ve -20 °C’de saklandı. Yaprak kalıntıları toz haline getirildi ve hücre duvarı bileşenleri için kullanıldı. POD aktivitesi ve karakterizasyonu, 5 mM guaiacol substratı ve H2O2 kullanılarak belirlendi ve 470 nm’de absorbanstaki değişiklik izlendi. β-1,3-glukanaz aktivitesi, pH ve sıcaklık optimum koşulları, β-1,3-glukan ve β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak DNS reaktifi ile hidrolizattaki toplam indirgeyici şekerlerin ölçülmesi, 540 nm’de absorbansın ölçülmesi ve glikoz standart eğrisi kullanılarak gösterilmiştir. Optimum pH, pH 4 ila 9 arasında, sıcaklık optimumu 25 ila 50 °C arasında ve termal stabilite 30 °C ile 70 °C arasında belirlendi. β-1,3-glukanaz substrat özgüllüğü, curdlan ve arpa β-1,3-1,4-glukan substratları kullanılarak 25 °C ve 40 °C’de belirlendi. Ek olarak, β-1,3-glukanaz etki modu, laminaribiyoz ila laminaripentaoz kullanılarak belirlendi. Oligosakkarit hidroliz ürün paternleri, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile kalitatif olarak analiz edildi ve HPLC ile kantitatif olarak analiz edildi. Bu çalışmada sunulan yöntem, buğdayın RWA ile istila edilmesi, hücre duvarı bölgesinden peroksidaz ve β-1,3-glukanazın ekstrakte edilmesi ve bunların kapsamlı biyokimyasal karakterizasyonu için sağlam bir yaklaşım göstermektedir.
Introduction
Rus buğday yaprak bitleri (RWA) buğday ve arpayı istila ederek önemli verim kaybına veya tahıl kalitesinin düşmesine neden olur. Buğday, dirençli çeşitlerde β-1,3-glukanaz ve peroksidaz aktivite seviyelerinin arttırılması da dahil olmak üzere çeşitli savunma tepkilerini indükleyerek istilaya yanıt verirken, duyarlı çeşitler erken istila döneminde bu enzimlerin aktivitesini azaltır 1,2,3,4. Buğday bitkisindeki β-1,3-glukanaz ve POD’un temel işlevleri, RWA istilası 1,3,5,6,7 sırasında dirençli kültivarda kalloz birikiminin düzenlenmesi ve hücre duvarında ve apoplastik bölgelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) söndürülmesini içeriyordu. Mafa ve ark.6, RWASA2 istilası üzerine dirençli buğday çeşidinde artan POD aktivitesi ile artan lignin içeriği arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Ek olarak, artan lignin içeriği, istila edilmiş dirençli buğday çeşidinin hücre duvarının güçlendirildiğini ve bunun da RWA beslemesinin azalmasına yol açtığını gösterdi.
Çoğu araştırmacı grubu, buğday / arpa-RWA etkileşimi sırasında apoplastik β-1,3-glukanaz ve POD’u çıkardı ve inceledi; Ek olarak, bu çalışmaların çoğu, bu enzimlerin, hücre duvarı bölgesindeki enzim varlığını ölçmeden RWA ile enfekte olmuş buğday bitkisinin hücre duvarını etkilediğini iddia etti. Sadece birkaç çalışma, β-1,3-glukanaz aktivite seviyelerinin kalloz regülasyonu 7,8,9 ile bağlantılı olduğunu veya dirençli 6,10’da POD aktiviteleri ile hücre duvarı modifikasyonu arasındaki korelasyonu göstermek için ekstrakte edilen ana hücre duvarı bileşenlerine bağlı olduğunu göstermek için mikroskobik teknikler kullanmıştır. Hücre duvarına β-1,3-glukanaz ve POD ilişkisinin araştırılmaması, araştırmacıların hücre duvarına bağlı enzimleri doğrudan ölçmelerine izin veren yöntemlerin geliştirilmesine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir.
Mevcut yöntem, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesinden önce apoplastik sıvının yaprak dokusundan çıkarılmasının gerekli olduğunu önermektedir. Apoplastik sıvının ekstraksiyon prosedürü, hücre duvarına bağlı enzimlerin ekstrakte edilmesi için kullanılan yaprak dokusundan iki kez yapılmalıdır. Bu işlem, apoplastik enzimlerin hücre duvarı bölgelerinde bulunanlarla kirlenmesini ve karışıklığını azaltır. Bu nedenle, bu çalışmada hücre duvarına bağlı POD, β-1,3-glukanaz ve MLG’ye özgü β-glukanaz ekstrakte edildi ve biyokimyasal karakterizasyonları gerçekleştirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Buğday ve arpa, Rus buğday yaprak bitleri (Diuraphis noxia) dahil olmak üzere yaprak biti türleri tarafından sıklıkla istila edilen tahıl ürünleridir7,24. Dirençli buğday bitkileri, kalloz ve lignin birikimini düzenleyerek hücre duvarını değiştirmek için istila dönemi boyunca savunma tepkileri olarak POD ve β-1,3-glukanaz aktivitelerinin yukarı regülasyonunu indükler 6,25,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa NMK-Thuthuka’dan fon aldı (Referans Numarası: TTK2204102938). SN Zondo, yüksek lisans derecesi için Ulusal Araştırma Vakfı Yüksek Lisans Bursunu aldı. Yazarlar, bu çalışmada kullanılan tohumları sağladığı için Tarımsal Araştırma Konseyi – Küçük Tahıl (ARC-SG) Enstitüsü’ne minnettardır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve tavsiye yazar(lar)a aittir ve bu nedenle fon sağlayıcılar bunlarla ilgili herhangi bir sorumluluk kabul etmez.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
References
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
- Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
- Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
- Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
- Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
- Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
- Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
- Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
- Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
- Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
- Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
- Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
- Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
- Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
- Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
- Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
- Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
- . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
- Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
- Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
- Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
- Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
- Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
- Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
.