Выяснение #946;-1,3-глюканаза и пероксидаза физико-химических свойств защитного механизма клеточной стенки пшеницы против заражения Diuraphis noxia
Summary
В настоящем протоколе описаны процедуры, используемые для изучения и характеристики ферментов, связанных с клеточной стенкой, главным образом β-1,3-глюканазы и пероксидазы, в растениях пшеницы. Уровень их активности увеличивается во время взаимодействия пшеницы и RWA и участвует в защитной реакции растений через укрепление клеточной стенки, что препятствует питанию тлей.
Abstract
Растения пшеницы, зараженные российской пшеничной тлей (RWA), вызывают каскад защитных реакций, включая гиперчувствительные реакции (HR) и индукцию белков, связанных с патогенезом (PR), таких как β-1,3-глюканаза и пероксидаза (POD). Целью данного исследования является характеристика физико-химических свойств ассоциированных с клеточной стенкой POD и β-1,3-глюканазы и определение их синергизма на модификацию клеточной стенки при взаимодействии RWASA2-пшеницы. Восприимчивые сорта Tugela, умеренно устойчивые Tugela-Dn1 и устойчивые Tugela-Dn5 были предварительно проращены и высажены в тепличных условиях, удобрены через 14 дней после посадки и орошены каждые 3 дня. Растения были заражены 20 партеногенетическими особями того же клона RWASA2 на стадии 3 листьев, а листья были собраны через 1-14 дней после заражения. Межклеточную промывочную жидкость (IWF) экстрагировали с помощью вакуумной фильтрации и хранили при температуре -20 °C. Остатки листьев измельчали в порошок и использовали в качестве компонентов клеточной стенки. Активность и характеристика POD определяли с использованием субстрата гваякола 5 мМ и H2O2, отслеживая изменение абсорбции при длине волны 470 нм. Активность β-1,3-глюканазы, рН и оптимальные температурные условия были продемонстрированы путем измерения общего редуцирующих сахаров в гидролизате реагентом DNS с использованием субстратов β-1,3-глюкана и β-1,3-1,4-глюкана, измерения абсорбции при 540 нм и использования стандартной кривой глюкозы. Оптимум pH определяли в диапазоне от pH 4 до 9, температурный оптимум от 25 до 50 °C и термостабильность в диапазоне от 30 °C до 70 °C. Специфичность субстрата β-1,3-глюканазы определяли при 25 °C и 40 °C с использованием субстратов из творожного и ячменного β-1,3-1,4-глюкана. Кроме того, определяли механизм действия β-1,3-глюканазы с помощью ламинарибиозы к ламинарипентаозе. Картины продуктов гидролиза олигосахаридов были качественно проанализированы с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и количественно проанализированы с помощью ВЭЖХ. Метод, представленный в данном исследовании, демонстрирует надежный подход к заражению пшеницы RWA, экстракцию пероксидазы и β-1,3-глюканазы из области клеточной стенки и их всестороннюю биохимическую характеристику.
Introduction
Российская пшеничная тля (RWA) поражает пшеницу и ячмень, вызывая значительные потери урожая или снижение качества зерна. Пшеница реагирует на заражение, вызывая несколько защитных реакций, включая повышение уровня активности β-1,3-глюканазы и пероксидазы у устойчивых сортов, в то время как восприимчивые сорта снижают активность этих ферментов в ранний период заражения 1,2,3,4. Ключевыми функциями β-1,3-глюканазы и POD в растении пшеницы являлись регулирование накопления каллозы в устойчивых сортах и гашение активных форм кислорода (АФК) в клеточной стенке и апопластических областях при заражении RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 продемонстрировали, что существует сильная корреляция между повышенной активностью POD и повышенным содержанием лигнина в устойчивом сорте пшеницы при заражении RWASA2. Кроме того, повышенное содержание лигнина указывало на то, что клеточная стенка зараженного устойчивого сорта пшеницы была усилена, что привело к снижению питания RWA.
Большинство исследовательских групп экстрагировали и изучали апопластическую β-1,3-глюканазу и POD во время взаимодействия пшеницы/ячменя и RWA; Кроме того, в большинстве этих исследований утверждалось, что эти ферменты влияют на клеточную стенку растения пшеницы, зараженного RWA, без измерения присутствия фермента в области клеточной стенки. Только в нескольких исследованиях использовались микроскопические методы, чтобы показать, что уровни активности β-1,3-глюканазы были связаны с регуляцией каллозы 7,8,9, или экстрагировались основные компоненты клеточной стенки, чтобы продемонстрировать корреляцию между активностью POD и модификацией клеточной стенки у резистентных 6,10. Отсутствие зондирования связи β-1,3-глюканазы и POD с клеточной стенкой указывает на необходимость разработки методов, позволяющих исследователям измерять непосредственно ферменты, связанные с клеточной стенкой.
Современный метод предполагает, что перед экстракцией ферментов, связанных с клеточной стенкой, необходимо удалить апопластическую жидкость из ткани листа. Процедура экстракции апопластической жидкости должна быть выполнена дважды из ткани листа, которая используется для извлечения ферментов, связанных с клеточной стенкой. Этот процесс уменьшает загрязнение и путаницу апопластических ферментов с ферментами, обнаруженными в областях клеточной стенки. Таким образом, в данном исследовании мы экстрагировали связанный с клеточной стенкой POD, β-1,3-глюканазу и MLG-специфичную β-глюканазу и выполнили их биохимическую характеристику.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пшеница и ячмень – зерновые культуры, часто зараженные видами тлей, в том числе русской пшеничной тлей (Diuraphis noxia)7,24. Устойчивые растения пшеницы индуцируют повышение активности POD и β-1,3-глюканазы в качестве защитных реакций на протяжении всего перио…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
М. Мафа получил финансирование от NRF-Thuthuka (номер заявки: TTK2204102938). С.Н. Зондо получил стипендию Национального исследовательского фонда для аспирантуры для получения степени магистра. Авторы выражают благодарность Институту Совета по сельскохозяйственным исследованиям – Малого зерна (ARC-SG) за предоставленные семена, использованные в этом исследовании. Любые мнения, выводы и рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат автору (авторам), и поэтому спонсоры не несут никакой ответственности в связи с этим.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
References
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
- Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
- Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
- Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
- Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
- Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
- Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
- Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
- Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
- Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
- Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
- Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
- Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
- Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
- Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
- Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
- Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
- . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
- Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
- Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
- Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
- Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
- Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
- Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
.