Opheldering #946;-1,3-glucanase en peroxidase fysisch-chemische eigenschappen van het verdedigingsmechanisme van de tarwecelwand tegen de besmetting met diuraphis noxia
Summary
Het huidige protocol beschrijft procedures die worden gebruikt om celwandgerelateerde enzymen, voornamelijk β-1,3-glucanase en peroxidase, in tarweplanten te bestuderen en te karakteriseren. Hun activiteitsniveaus nemen toe tijdens de interactie tussen tarwe en RWA en zijn betrokken bij de afweerreactie van de plant door middel van celwandversterking, wat de voeding van bladluizen afschrikt.
Abstract
Tarweplanten die zijn aangetast door Russische tarwebladluizen (RWA) induceren een cascade van afweerreacties, waaronder de overgevoelige reacties (HR) en inductie van pathogenese-gerelateerde (PR) eiwitten, zoals β-1,3-glucanase en peroxidase (POD). Deze studie heeft tot doel de fysisch-chemische eigenschappen van celwand-geassocieerde POD en β-1,3-glucanase te karakteriseren en hun synergisme op de celwandmodificatie tijdens RWASA2-tarwe-interactie te bepalen. De vatbare Tugela, matig resistente Tugela-Dn1 en resistente Tugela-Dn5 cultivars werden voorgekiemd en geplant onder kasomstandigheden, 14 dagen na het planten bemest en elke 3 dagen geïrrigeerd. De planten werden besmet met 20 parthenogenetische individuen van dezelfde RWASA2-kloon in het 3-bladstadium en de bladeren werden 1 tot 14 dagen na de besmetting geoogst. De intercellulaire wasvloeistof (IWF) werd geëxtraheerd met behulp van vacuümfiltratie en opgeslagen bij -20 °C. Bladresten werden tot poeder vermalen en gebruikt voor celwandcomponenten. POD-activiteit en karakterisering werden bepaald met behulp van 5 mM guaicol-substraat en H2O2, waarbij de verandering in absorptie bij 470 nm werd gevolgd. β-1,3-glucanase-activiteit, pH en optimale temperatuuromstandigheden werden aangetoond door de totale reducerende suikers in het hydrolysaat te meten met DNS-reagens met behulp van β-1,3-glucaan- en β-1,3-1,4-glucaansubstraten, de absorptie bij 540 nm te meten en de glucosestandaardcurve te gebruiken. Het pH-optimum werd bepaald tussen pH 4 en 9, het temperatuuroptimum tussen 25 en 50 °C en de thermische stabiliteit tussen 30 °C en 70 °C. De specificiteit van het β-1,3-glucanasesubstraat werd bepaald bij 25 °C en 40 °C met behulp van wrongel- en gerst-β-1,3-1,4-glucaansubstraten. Bovendien werd het werkingsmechanisme van β-1,3-glucanase bepaald met behulp van laminaribiose tot laminaripentaose. De productpatronen van de oligosaccharidehydrolyse werden kwalitatief geanalyseerd met dunnelaagchromatografie (TLC) en kwantitatief geanalyseerd met HPLC. De methode die in deze studie wordt gepresenteerd, demonstreert een robuuste aanpak voor het besmetten van tarwe met RWA, waarbij peroxidase en β-1,3-glucanase uit het celwandgebied worden geëxtraheerd en hun uitgebreide biochemische karakterisering.
Introduction
Russische tarwebladluizen (RWA) besmetten tarwe en gerst, wat leidt tot aanzienlijk opbrengstverlies of vermindering van de graankwaliteit. Tarwe reageert op besmetting door verschillende afweerreacties op te wekken, waaronder het verhogen van de activiteitsniveaus β-1,3-glucanase en peroxidase in de resistente cultivars, terwijl gevoelige cultivars de activiteit van deze enzymen verminderen in de vroege plaagperiode 1,2,3,4. De belangrijkste functies van β-1,3-glucanase en POD in de tarweplant waren onder meer het reguleren van de callose-accumulatie in de resistente cultivar en het blussen van reactieve zuurstofsoorten (ROS) aan de celwand en apoplastische gebieden tijdens RWA-besmetting 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 toonden aan dat er een sterke correlatie was tussen de verhoogde POD-activiteit en het verhoogde ligninegehalte in de resistente tarwecultivar op RWASA2-plagen. Bovendien gaf een verhoogd ligninegehalte aan dat de celwand van de besmette resistente tarwecultivar was versterkt, wat leidde tot verminderde RWA-voeding.
De meeste onderzoeksgroepen extraheerden en bestudeerden apoplastische β-1,3-glucanase en POD tijdens de tarwe/gerst-RWA-interactie; Bovendien beweerden de meeste van deze onderzoeken dat deze enzymen de celwand van de met RWA besmette tarweplant beïnvloeden zonder de aanwezigheid van enzymen in het celwandgebied te meten. Slechts enkele studies hebben microscopische technieken gebruikt om aan te tonen dat β-1,3-glucanase-activiteitsniveaus verband hielden met calloseregulatie 7,8,9 of geëxtraheerde belangrijke celwandcomponenten om de correlatie tussen POD-activiteiten en celwandmodificatie in de resistente 6,10 aan te tonen. Het ontbreken van het onderzoeken van de β-1,3-glucanase en POD-associatie met de celwand wijst op de noodzaak om methoden te ontwikkelen waarmee onderzoekers de celwandgebonden enzymen rechtstreeks kunnen meten.
De huidige methode stelt voor dat het noodzakelijk is om de apoplastische vloeistof uit het bladweefsel te verwijderen voordat de celwandgebonden enzymen worden geëxtraheerd. De extractieprocedure van apoplastische vloeistof moet twee keer worden uitgevoerd uit het bladweefsel, dat wordt gebruikt voor het extraheren van de celwandgebonden enzymen. Dit proces vermindert contaminatie en verwarring van de apoplastische enzymen met die in de celwandregio’s. Daarom hebben we in deze studie celwandgebonden POD, β-1,3-glucanase en MLG-specifieke β-glucanase geëxtraheerd en hun biochemische karakterisering uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarwe en gerst zijn graangewassen die vaak worden aangetast door bladluissoorten, waaronder Russische tarweluizen (Diuraphis noxia)7,24. Resistente tarweplanten induceren de opregulatie van POD- en β-1,3-glucanase-activiteiten als afweerreacties gedurende de plaagperiode om de celwand te wijzigen door de accumulatie van callose en lignine te reguleren 6,25,26,27.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa ontving financiering van de NRF-Thuthuka (referentienummer: TTK2204102938). S.N. Zondo ontving de National Research Foundation Postgraduate Scholarship voor zijn MSc-graad. De auteurs zijn het Agricultural Research Council – Small Grain (ARC-SG) Institute dankbaar voor het verstrekken van de zaden die in deze studie zijn gebruikt. Alle meningen, bevindingen en aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteur(s) en daarom aanvaarden de financiers geen enkele aansprakelijkheid in verband daarmee.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
References
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
- Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
- Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
- Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
- Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
- Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
- Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
- Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
- Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
- Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
- Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
- Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
- Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
- Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
- Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
- Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
- Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
- . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
- Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
- Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
- Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
- Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
- Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
- Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
.