הבהרת #946;-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז תכונות פיסיקוכימיות של מנגנון ההגנה על דופן תא החיטה מפני התפשטות Diuraphis noxia
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המשמשים לחקר ואפיון אנזימים הקשורים לדופן התא, בעיקר β-1,3-גלוקנה ופרוקסידז, בצמחי חיטה. רמות הפעילות שלהם עולות במהלך אינטראקציה חיטה-RWA והם מעורבים בתגובת ההגנה של הצמח באמצעות חיזוק דופן התא, אשר מרתיע הזנת כנימות.
Abstract
צמחי חיטה שורצי כנימות חיטה רוסיות (RWA) גורמים לשרשרת של תגובות הגנה, כולל תגובות רגישות יתר (HR) ואינדוקציה של חלבונים הקשורים לפתוגנזה (PR), כגון β-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז (POD). מחקר זה נועד לאפיין את התכונות הפיזיקוכימיות של POD ו- β-1,3-גלוקנאז הקשורים לדופן התא ולקבוע את הסינרגיזם שלהם על שינוי דופן התא במהלך אינטראקציה RWASA2-חיטה. זני Tugela-Dn1 הרגישים והעמידים Tugela-Dn5 העמידים הונבטו ונשתלו בתנאי חממה, הופרו 14 יום לאחר השתילה והושקו כל 3 ימים. הצמחים היו שורצים 20 פרטים פרתנוגנטיים של אותו שיבוט RWASA2 בשלב 3 העלים, והעלים נקטפו 1 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות. נוזל השטיפה הבין-תאי (IWF) הופק באמצעות סינון ואקום ואוחסן בטמפרטורה של -20°C. שאריות העלים נמעכו לאבקה ושימשו לרכיבי דופן התא. פעילות ה-POD ואפיונו נקבעו באמצעות מצע גואיאקול 5 mM ו-H2O2, תוך ניטור השינוי בספיגה ב-470 ננומטר. פעילות β-1,3-גלוקנאז, pH ותנאים אופטימליים של טמפרטורה הודגמו על ידי מדידת סך כל הסוכרים המפזרים בהידרוליזה עם מגיב DNS באמצעות מצעים β-1,3-גלוקן ו-β-1,3-1,4-גלוקן, מדידת הספיגה ב-540 ננומטר ושימוש בעקומת תקן גלוקוז. ה- pH האופטימלי נקבע בין pH 4 ל -9, טמפרטורה אופטימלית בין 25 ל -50 ° C, ויציבות תרמית בין 30 ° C ל 70 ° C. ספציפיות מצע β-1,3-גלוקנה נקבעה ב 25 ° C ו 40 ° C באמצעות מצעי curdlan ושעורה β-1,3-1,4-גלוקן. בנוסף, אופן הפעולה β-1,3-גלוקנאז נקבע באמצעות למינריביוז ללמינריפנטאוז. תבניות המוצר של הידרוליזה אוליגוסכרידית נותחו באופן איכותי עם כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) ונותחו כמותית עם HPLC. השיטה המוצגת במחקר זה מדגימה גישה איתנה להשרצת חיטה עם RWA, מיצוי פרוקסידז ו- β-1,3-גלוקנאז מאזור דופן התא ואפיונם הביוכימי המקיף.
Introduction
כנימות חיטה רוסיות (RWA) שורצות חיטה ושעורה, וגורמות לאובדן יבול משמעותי או לירידה באיכות התבואה. חיטה מגיבה להתפשטות על ידי גרימת מספר תגובות הגנה, כולל העלאת רמות הפעילות של β-1,3-גלוקן ופרוקסידז בזנים העמידים, בעוד שזנים רגישים מפחיתים את הפעילות של אנזימים אלה בתקופת התפשטות מוקדמת 1,2,3,4. תפקידי המפתח של β-1,3-גלוקנאז ו-POD בצמח החיטה כללו ויסות הצטברות קלוזה בזני הזנים העמידים והחמצן הריאקטיבי (ROS) המרווה בדופן התא ובאזורים אפופלסטיים במהלך התפשטות RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 הראו כי היה מתאם חזק בין פעילות POD מוגברת לבין תכולת ליגנין מוגברת בזן החיטה העמיד על נגיעות RWASA2. בנוסף, תכולת ליגנין מוגברת הצביעה על כך שדופן התא של זן החיטה העמיד שורץ חוזקה, מה שהוביל להזנת RWA מופחתת.
רוב קבוצות החוקרים חילצו וחקרו אפופלסטיק β-1,3-גלוקנאז ו-POD במהלך האינטראקציה חיטה/שעורה-RWA; בנוסף, רוב המחקרים הללו טענו כי אנזימים אלה משפיעים על דופן התא של צמח החיטה שורץ RWA מבלי למדוד את נוכחות האנזים באזור דופן התא. רק מחקרים מעטים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיות כדי להראות כי רמות הפעילות של β-1,3-גלוקנאז היו קשורות לוויסות קלוזה 7,8,9 או חילצו רכיבים עיקריים של דופן התא כדי להדגים את המתאם בין פעילויות POD ושינוי דופן התא ב- 6,10 העמיד. היעדר חיטוט הקשר β-1,3-גלוקנאז ו-POD לדופן התא מצביע על הצורך בפיתוח שיטות שיאפשרו לחוקרים למדוד ישירות את האנזימים הקשורים לדופן התא.
השיטה הנוכחית מציעה כי יש צורך בהסרת הנוזל האפופלסטי מרקמת העלה לפני מיצוי האנזימים הקשורים לדופן התא. הליך המיצוי של נוזל אפופלסטי חייב להתבצע פעמיים מרקמת העלה, המשמשת לחילוץ האנזימים הקשורים לדופן התא. תהליך זה מפחית את הזיהום והבלבול של האנזימים האפופלסטיים עם אלה הנמצאים באזורי דופן התא. לכן, במחקר זה, חילצנו POD הקשור לדופן התא, β-1,3-גלוקנאז ו-β-גלוקנאז ספציפיים ל-MLG וביצענו את האפיון הביוכימי שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיטה ושעורה הם גידולי דגנים שורצים לעתים קרובות על ידי מיני כנימות, כולל כנימות חיטה רוסיות (Diuraphis noxia)7,24. צמחי חיטה עמידים גורמים להגברת הרגולציה של פעילויות POD ו- β-1,3-גלוקנאז כתגובות הגנה לאורך כל תקופת ההתפשטות לשינוי דופן התא על ידי ויסות הצטברות קלו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M. Mafa קיבל מימון מה-NRF-Thuthuka (מספר סימוכין: TTK2204102938). S.N. Zondo קיבל את מלגת הקרן הלאומית למחקר לתואר שני לתואר שני שלו. המחברים אסירי תודה למועצה למחקר חקלאי – מכון דגנים קטנים (ARC-SG) על אספקת הזרעים ששימשו במחקר זה. כל דעה, ממצאים והמלצות המובעות בחומר זה הן של המחבר/ים, ולפיכך המממנים אינם מקבלים על עצמם כל אחריות בקשר לכך.
Materials
| 10 kDa Centrifuge concentrating membrane device | Sigma-Aldrich | R1NB84206 | For research use only. Not for use in Diagnostic procedures. For concentration and purification of biological solutions. |
| 2 g Laminaribiose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM2 | High purity laminaribiose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3 g Laminaritriose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM3 | High purity laminaritriose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 3,5 Dinitro salicylic acid | Sigma-Aldrich | D0550 | Used in colorimetric determination of reducing sugars |
| 4 g Laminaritetraose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM4 | High purity laminaritetraose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 5 g Laminaripentaose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | O-LAM5 | High purity laminaripentaose for use in research, biochemical enzyme assays and in vitro diagnostic analysis. |
| 95% Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 107017 | Ethanol absolute for analysis |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | B00063 | Acetc acid glacial 100% for analysis (contains acetic acid) |
| Azo-CM-Cellulose | Megazyme (Wicklow, Ireland) | S-ACMC | The polysaccharide is dyed with Remazolbrilliant Blue R to an extent of approx. one dye molecule per 20 sugar residues. |
| Beta glucan (barley) | Megazyme (Wicklow, Ireland) | G6513 | A powdered substrate, less soluble in water. Used in determining β-1,3-glucanase activity. |
| Bio-Rad Protein Assay Dye | Bio-Rad Laboratories, South africa | 500-0006 | Colorimetric assay dye, concentrate, for use with Bio-Rad Protein Assay Kits I and II |
| Bovine serum albumin (BSA) | Gibco Europe | 810-1018 | For Laboratory use only |
| Citrate acid | Sigma-Aldrich | C0759 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| CM-curdlan | Megazyme (Wicklow, Ireland) | P-CMCUR | Powdered substrate for determining β-1,3-glucanase activity. Insoluble in water. |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | For Life Science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| Guaiacol | Sigma-Aldrich | G5502 | Oxidation indicator. Used for determining peroxidase activity. |
| Hydrogen peroxide | BDH Laboratory Supplies, England | 10366 | Powerful oxidising agent. |
| Mikskaar Professional Substarte | Mikskaar (Estonia) | NI | Peat moss-based seedling substrate. |
| Multifeed fertiliser (5.2.4 (43)) | Multifeed Classic | B1908248 | A water soluble fertiliser for young developing plants and seedlings with a high phosphorus (P) requirement to ensure optimum root development. |
| Naphthol | Merck, Germany | N2780 | Undergoes hydrogenations in the presence of a catalyst. |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 33517 | Light sensitive. For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. SDS available |
| Potassium sodium tartrate tetrahydrate (Rochelle salt) | Sigma-Aldrich | S2377 | used in the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solution used in the determination of the reducing sugar. |
| Silica plate (TLC Silica gel 60 F254) | Sigma-Aldrich | 60778-25EA | Silica gel matrix, with fluorescent indicator 254 nm |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | For R&D use only. Not for drug, household, or other uses. |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | Added as an antioxidant during the preparation of 3,5-dinitrosalicylic acid solutions. |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | S9390 | Used as a buffer solution in biological research to keep the pH constant. |
| Sodium phosphate monobasic heptahydrate | Sigma-Aldrich | 71500 | An inorganic compound, which is soluble in water. Used as a reagent in the development of silicate-based grouts. |
| Statistical analysis software | TIBCO Statistica | version 13.1 | |
| Sulfuric acid | Merck, Darmstadt, Germany | 30743 | Sulfuric acid 95-97% for analysis of Hg, ACS reagent. |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | 10812846001 | Buffering agent in incubation mixtures. It has also been used as a component of lysis and TE (Tris-EDTA) buffer. For life science research only. Not for use in diagnostic procedures. |
| UV–Visible Spectrophotometer | GENESYS 120 | ||
| NI = not identified. |
References
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
- Mohase, L., Van der Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
- Moloi, M. J., Van der Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
- Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
- Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
- Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
- Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects – A review. J Plant Physiol. 269, 153582 (2022).
- Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
- Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
- Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
- Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
- Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
- Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
- Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
- Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
- Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , (2008).
- Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94 (2011).
- Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
- . GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
- Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under drought stress. Plants. 11 (3), 394 (2022).
- Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
- Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
- Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358 (2014).
- Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747 (2021).
- Van der Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
- Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).
.