Summary

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Published: June 21, 2024
doi:

Summary

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Abstract

Merkezi sinir sisteminden (CNS) türetilenler gibi doku kesitlerinde bağışıklık hücresi çeşitliliğini araştırmak için histolojinin kullanımı, tek bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısı ile kritik bir şekilde sınırlıdır. Çoğu bağışıklık hücresi alt kümesi, protein belirteçlerinin karmaşık kombinasyonları kullanılarak akış sitometrisi kullanılarak tanımlanmıştır, bu genellikle kesin olarak tanımlamak için dört veya daha fazla parametre gerektirir, bu da çoğu geleneksel mikroskobun yeteneklerinin ötesindedir. Akış sitometrisi dokuları ayrıştırdığından ve uzamsal bilgiyi kaybettiğinden, karmaşık hücre tiplerinin rollerini sorgularken uzamsal bilgiyi koruyabilen tekniklere ihtiyaç vardır. Bu sorunlar burada, spektral olarak örtüşen floroforların sinyallerini toplayarak ve her bir ayrı floroforun sinyallerini ayırmak için spektral karıştırma kullanarak görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişletmek için bir yöntem oluşturularak ele alınmaktadır. Bu görüntüler daha sonra yüksek parametreli histoloji görüntüleri almak ve bu görüntülerden tek hücreleri çıkarmak için bir analiz hattı kullanılarak işlenir, böylece her hücrenin benzersiz floresan özellikleri tek hücre düzeyinde analiz edilebilir. Akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanılarak, hücreler daha sonra alt kümelere ayrılabilir ve yalnızca bolluklarını ölçmekle kalmayıp aynı zamanda doku ortamıyla nasıl etkileşime girdiklerini belirlemek için histoloji bölümlerine geri eşlenebilir. Genel olarak, histoloji bölümlerinde karmaşık immün popülasyonları incelemek için histoflow sitometri kullanmanın basitliği ve potansiyeli gösterilmiştir.

Introduction

Bağışıklık sistemi hücreleri ve glial hücreler tarafından yönlendirilen iltihaplanma, her bir popülasyonun diğer 1,2,3’ün aktivitesini teşvik edebileceği CNS’nin kronik bozukluklarına katkıda bulunabilir. Bağışıklık sisteminin, CNS inflamasyonunu teşvik etmek için CNS’nin bu unsurları ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak şu anda önemli bir ilgi konusudur ve tek hücreli RNA dizilimi gibi yüksek parametreli tekniklerle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi sayesinde, çeşitli CNS bozukluklarındaglial hücreler ve bağışıklık sistemi arasında geniş bir iletişim olduğunu keşfettik 4,5,6. Bu etkileşimlerin bu bozuklukları nasıl etkilediğini anlamak, bu hastalıkların biyolojisini aydınlatmak için çok önemli olacaktır.

Tek hücreli dizileme analizleriyle ilgili bir sorun, bu tekniklerin tek hücreler veya çekirdekler elde etmek için dokunun bozulmasını gerektirmesi ve bunun da tam bir uzamsal bilgi kaybına neden olmasıdır. Bir hücrenin bir dokuda nerede bulunduğunu bilmek, hücrenin iltihabı yönlendirmedeki rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, B hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, nöroinflamasyon sırasında CNS’de konsantre olabilir; bununla birlikte, nadiren CNS parankimine girerler ve bunun yerine CNS bariyerlerine7 konsantre olurlar. Lokalizasyonları göz önüne alındığında, bu hücrelerin CNS parankimindeki glial hücrelerle fiziksel olarak etkileşime girerek CNS inflamasyonuna katkıda bulunmaları olası değildir, bu da glial hücrelerle sahip olabilecekleri herhangi bir etkileşimin salgılanan faktörler yoluyla gerçekleşeceğini düşündürür. Ek olarak, CNS bozukluklarında ortaya çıkan patoloji genellikle 8,9 yapısına sahiptir, öyle ki bir hücrenin dokudaki lokalizasyonu, bozukluğa aktif olarak katkıda bulunup bulunmadığını veya bir seyirci olup olmadığını kritik olarak belirleyebilir. Bu nedenle, bir hücrenin patolojideki rolünü değerlendirmek için uzamsal yönelimin kullanılması esastır.

Dokudaki hücrelerin incelenmesi tipik olarak immünohistokimya veya immün floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniklerle ilgili bir sorun, tipik olarak aynı anda en fazla dört parametreyi görüntüleyebilmeleridir. Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme analizlerinden bildiğimiz gibi, birçok hücre popülasyonunun tanımlanması için iki veya daha fazla parametreye ihtiyaç duyduğunu bildiğimiz için, bu teknikler için önemli bir sınırlamadır; Ayrıca, bir hücre tipi10’un belirli alt kümelerini ararken gereken parametrelerin sayısı tipik olarak artar. Bu nedenle, hücre alt kümelerinin bir doku içinde nasıl etkileşime girebileceğini incelemek için standart görüntüleme tekniklerini kullanmak pratik değildir.

Bu sorun, uzamsal RNA dizilimi11 ve görüntüleme kütle sitometrisi12 gibi uzamsal bilgileri koruyabilen daha yeni yüksek parametreli yöntemlerle kısmen aşılmıştır. Bu teknikler değerli olsa da, yaygın olarak bulunamama, üç boyutlu verileri iki boyuta indirgeme ve yürütme konusunda önemli uzmanlık gerektirme gibi çeşitli sorunları vardır. Dokuların bir antikor seti ile boyandığı ve ardından başka bir antikor seti ile boyanmadan önce önceki antikor setinin inaktive edildiği sıralı boyama olarak bilinen başka bir teknik, özel ekipman veya uzmanlığa ihtiyaç duymadan yüksek parametreli histoloji elde edebilir 13,14,15. Bununla birlikte, sıralı boyama son derece emek yoğun olabilir ve büyük miktarda mikroskopi süresi gerektirir, bu da kişisel mikroskobu olmayan laboratuvarlar için pratik olmayabilir. Bu nedenle, yaygın olarak bulunan mikroskoplarda bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını ve zamanında genişletilebilen tekniklere ihtiyaç vardır.

Yüksek parametreli veriler elde edildikten sonra, başka bir sorun ortaya çıkar: geleneksel görüntü analizi yöntemlerinin verileri başarılı bir şekilde analiz etmesi pek olası değildir. Manuel sayma veya eşikleme gibi teknikler, yalnızca analiz tek bir parametreden oluşuyorsa veya yalnızca çakışan sinyallerin sayıldığı birden fazla işaretleyici aynı lokalizasyona sahipse geçerlidir. Bu sınırlama, geleneksel analizi yüksek parametreli veri kümeleriyle çalışmak için yetersiz hale getirir. Bu veri kümelerinin başarılı analizi, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin bölümlere ayrılması ve ardından hücre tiplerini tanımlamak için akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yürütülmesiyle elde edilmiştir16,17. Bununla birlikte, bu analizleri etkileyen bir diğer konu da, yalnızca ilgilenilen tüm hücrelerin fiziksel olarak birbirinden ayrıldığı veri kümeleri için çalışmalarıdır, çünkü bu teknikler fiziksel temas halinde olan hücreleri doğru bir şekilde ayırabilecek yöntemler kullanmaz. Bu nedenle, hücreler fiziksel temas halinde olsa bile histoloji kesitleri üzerinde tek hücreli analizler yapabilen daha yeni bir yöntem gereklidir.

Bu makalede, daha önce tanıtılanve yaygın olarak bulunan mikroskoplar kullanılarak aynı anda görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişleten histoflow sitometri adı verilen basit bir protokol açıklanmaktadır 18. Bu protokol, dokuları spektral olarak örtüşen boyalarla boyayarak ve daha sonra net tek lekeler elde etmek için üst üste binen kanallardan kanamayı gidermek için spektral kompanzasyon kullanarak çalışır. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin analizini kolaylaştırmak için, akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanarak hücreleri farklı popülasyonlara ayırmak amacıyla doku bölümlerinden tek hücreleri çıkaran ayrıntılı bir analiz hattı açıklanmaktadır. Bu protokol, hücrelerin yaygın olarak bulunduğu dokularda ve hücrelerin birbirine sıkı sıkıya sıkıştırıldığı dokularda çalışır ve bu tekniği hem homeostaz hem de nöroinflamasyonda CNS gibi dokuların incelenmesi için çok yönlü hale getirir. Bu nedenle, histoflow sitometri, uzamsal bilgileri korurken hücreleri tanımlamak için birden fazla hücre işaretleyicisi gerektiren karmaşık hücre tipleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı bir tekniktir.

Protocol

Bu protokol histoloji için dokuların kesitini kapsamaz; histoloji için dokuların nasıl kesileceğine dair açıklamalar için lütfen Jain ve ark.18 veya19’a bakınız. Bu protokol, cam slaytlar üzerindeki herhangi bir kesitli doku ile kullanılabilir. Bu makale, daha önce tarif edildiği gibi aşılanmış bir hayvandan izole edilen kasık lenf nodlarını kullanır18. Bu protokolün prosedürü ve zaman çizelgesi Şekil…

Representative Results

Şekil 1: Histoflow sitometri iş akışı. Doku kesitleri spektral olarak örtüşen boyalarla boyanır (adım 1). Görüntüler, floroforlar arasındaki spektral sızıntıyı en aza indirmek için ayarlanabilir bant geçiren filtrelerle eşleştirilmiş bireysel uyarma lazerleri arasında toplanır (adım 2). Kanallar arasındaki spektral kanama,…

Discussion

Burada, daha önce doğrulanmış bir teknik olan histoflow sitometrisinin kullanımı açıklanmaktadır18. Doku kesitlerini spektral olarak örtüşen boyalarla boyarken, kanallar arasındaki kanamanın spektral kompanzasyon kullanılarak giderilebileceği ve bunun sonucunda normalde geleneksel yöntemlerle mümkün olandan daha fazla sayıda floresan parametresinin net bir şekilde çözüldüğü gösterilmiştir. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin geleneksel yöntemler kullanıla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Görüntüleme altyapısı ve uzmanlığı için Hotchkiss Beyin Enstitüsü Gelişmiş Mikroskopi Platformu’na teşekkür ederiz. RWJ, Calgary Üniversitesi Göz Lisesi programından doktora sonrası burs fonu ve Kanada Multipl Skleroz Derneği ve Roche Kanada sınırsız eğitim bursu tarafından desteklendi. VWY, Kanada Araştırma Koltuğu Tier 1 programından maaş desteği aldı. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri Hibe 1049959, Kanada Multipl Skleroz Derneği Hibe 3236 ve Kongre Tarafından Yönetilen Multipl Skleroz Araştırma Programı ABD Savunma Bakanlığı’nın işletme fonları ile desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu yayında uyarlanan rakamlar ilk olarak The Journal of Immunology’de yayınlandı. Rajiv W. Jain, David A. Elliott ve V. Wee Yong. 2023. Histoflow Sitometri Kullanılarak Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Tek Hücre Analizi. J. İmmünol. 210: 2038-2049. Telif Hakkı © [2023]. Amerikan İmmünologlar Derneği, Inc.

Materials

100% Ethanol Sigma 676829-1L
4% PFA Electron Microscopy Sciences 157-4
Anaconda N/A N/A https://www.anaconda.com/download
Bovine Serum Albumin Sigma A4503-50G
Cold fish stain gelatin  Sigma G7765
Collating multichannel data from Imaris.ipynb script N/A N/A https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script N/A N/A https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-
Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 JacksonImmunoResearch 712-605-153 1:300 concentration
Donkey anti-rat DyLight 405 Jackson ImmunoResearch 712-475-153 1:200 concentration
Donkey Serum JacksonImmunoResearch 017-000-001
F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 Thermofisher 46-4010-82 1:25 concentration
FIJI N/A N/A https://imagej.net/software/fiji/
FlowJo FlowJo LLC Software 4
Fluorescence spectraviewer https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Fresh frozen human tonsil sections amsbio HF-707
Glass coverslip VWR 48393 106
Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 JacksonImmunoResearch 109-546-011 1:400 concentration
Goat anti-human IgG Cy3 JacksonImmunoResearch 709-166-098 1:400 concentration
Goat anti-human IgM Dylight 405 JacksonImmunoResearch 109-476-129 1:300 concentration
Goat anti-rabbit A546 Thermo Fisher Scientific A-11035 1:250 concentration
Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 Thermofisher A-20981 1:250 concentration
Horse Serum Sigma H1138
Ilastik N/A N/A https://www.ilastik.org/
Ilastik FIJI plugin N/A N/A https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin
Imaris File Converter Oxford Instruments Software 2
Imaris with cell module Oxford Instruments Software 3
kimwipe Kimtech 34155
LasX Life Science software Leica Software 1
Mouse anti-human CD20 VWR CA95024-322 1:40 concentration
Mouse anti-human CD38 APC-R700 BD Biosciences 564980 1:20 concentration
Normal Goat Serum JacksonImmunoResearch 005-000-001
Normal Mouse Serum JacksonImmunoResearch 015-000-001
Normal Rabbit Serum JacksonImmunoResearch 011-000-001
Normal Rat Serum JacksonImmunoResearch 012-000-120
Nuclear Yellow Abcam ab138903 Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark
PAP pen Cedarlane MU22
PBS Gibco 10010-023
Rabbit anti-human Ki67 Abcam ab15580 1:500 concentration
Rabbit anti-mouse Iba1 Wako 019-19741 1:500 concentration
Rat anti-human Blimp1 Thermofisher 14-5963-82 1:40 concentration
Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 BioLegend 103226 1:250 concentration
Rat anti-mouse CD138 Biolegend 142502 1:200 concentration
Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 Thermo Fisher Scientific 61-0032-82 1:40 concentration
Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 BioLegend 100529 1:200 concentration
Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 BD Biosciences 565478 1:50 concentration
Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5993-82 1:50 concentration
SP8 Confocal microscope Leica
Triton X-100 Sigma X100-500ml
Trueblack Biotium 23007
Tween-20 Sigma P7949-500ml
Ultracomp ebeads Thermofisher 01-2222-42

References

  1. Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
  2. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
  3. Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
  4. Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
  5. Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
  6. Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
  7. Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
  8. Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
  9. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  10. Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
  11. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
  12. Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
  13. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  15. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  16. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  17. Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
  18. Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
  19. JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  22. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  23. Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
  24. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
  25. Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
  26. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  27. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
  28. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).

Play Video

Cite This Article
Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Generating and Analyzing High-Parameter Histology Images with Histoflow Cytometry. J. Vis. Exp. (208), e66889, doi:10.3791/66889 (2024).

View Video