Generierung und Analyse von High-Parameter-Histologiebildern mit Histoflow-Zytometrie

Entzündungen, die von Zellen des Immunsystems und Gliazellen ausgelöst werden, können zu chronischen Erkrankungen des ZNS beitragen, bei denen jede Population die Aktivität der anderen fördern kann ^1,2,3. Zu verstehen, wie das Immunsystem mit diesen Elementen des ZNS interagiert, um eine ZNS-Entzündung zu fördern, ist derzeit ein wichtiges Thema von Interesse und wurde durch hochparametrische Techniken wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung erheblich erleichtert. Durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung haben wir entdeckt, dass bei mehreren ZNS-Erkrankungen eine umfangreiche Kommunikation zwischen Gliazellen und dem Immunsystem stattfindet ^4,5,6. Zu verstehen, wie sich diese Wechselwirkungen auf diese Erkrankungen auswirken, wird entscheidend sein, um die Biologie dieser Krankheiten aufzuklären.

Ein Problem bei Einzelzellsequenzierungsanalysen besteht darin, dass bei diesen Techniken das Gewebe aufgebrochen werden muss, um einzelne Zellen oder Zellkerne zu erhalten, was zu einem vollständigen Verlust der räumlichen Information führt. Zu wissen, wo sich eine Zelle in einem Gewebe befindet, ist entscheidend, um die Rolle der Zelle bei der Entstehung von Entzündungen zu verstehen. Zum Beispiel können sich Immunzellen wie B-Zellen während einer Neuroinflammation im ZNS konzentrieren; sie dringen jedoch selten in das ZNS-Parenchym ein und konzentrieren sich stattdessen in den ZNS-Schranken⁷. Angesichts ihrer Lokalisation ist es unwahrscheinlich, dass diese Zellen zur ZNS-Entzündung beitragen, indem sie physisch mit Gliazellen im ZNS-Parenchym interagieren, was darauf hindeutet, dass Wechselwirkungen, die sie mit Gliazellen haben könnten, durch sezernierte Faktoren erfolgen würden. Darüber hinaus weist die bei ZNS-Erkrankungen auftretende Pathologie häufig eine Struktur ^8,9 auf, so dass die Lokalisation einer Zelle im Gewebe entscheidend bestimmen könnte, ob sie aktiv zu der Störung beiträgt oder ein Zuschauer ist. Daher ist die Verwendung der räumlichen Orientierung zur Bewertung der Rolle einer Zelle in der Pathologie unerlässlich.

Die Untersuchung von Zellen im Gewebe wurde in der Regel mit Hilfe der Immunhistochemie oder der Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt. Ein Problem bei diesen Techniken besteht darin, dass sie in der Regel nur bis zu vier Parameter gleichzeitig abbilden können. Dies ist eine große Einschränkung dieser Techniken, da wir aus der Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen wissen, dass viele Zellpopulationen zwei oder mehr Parameter für ihre Identifizierung benötigen; Außerdem erhöht sich die Anzahl der erforderlichen Parameter in der Regel, wenn nach bestimmten Teilmengen einer Zelle vom Typ¹⁰ gesucht wird. Daher ist es unpraktisch, Standard-Bildgebungsverfahren zu verwenden, um zu untersuchen, wie Untergruppen von Zellen innerhalb eines Gewebes interagieren können.

Dieses Problem wurde teilweise durch neuere Methoden mit hohen Parametern überwunden, die räumliche Informationen speichern können, wie z. B. die räumliche RNA-Sequenzierung¹¹ und die bildgebende Massenzytometrie¹². Diese Techniken sind zwar wertvoll, haben aber mehrere Probleme, wie z. B. dass sie nicht überall verfügbar sind, dreidimensionale Daten in zwei Dimensionen reduzieren und viel Fachwissen für die Ausführung erfordern. Eine andere Technik, die als sequentielle Färbung bekannt ist, bei der Gewebe mit einem Satz Antikörper gefärbt werden, gefolgt von einer Inaktivierung des vorherigen Antikörpersatzes, bevor sie mit einem anderen Satz von Antikörpern gefärbt werden, kann eine Histologie mit hohen Parametern erreichen, ohne dass spezielle Geräte oder Fachwissen erforderlich sind 13,14,15. Die sequentielle Färbung kann jedoch äußerst arbeitsintensiv sein und erfordert eine große Menge an Mikroskopiezeit, was für Labore, die kein persönliches Mikroskop besitzen, unpraktisch sein kann. Daher besteht ein Bedarf an Techniken, die die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitern können, die gleichzeitig auf Mikroskopen abgebildet werden können, die weit verbreitet und zeitnah abgebildet werden können.

Sobald die Daten mit hohen Parametern erfasst wurden, stellt sich ein weiteres Problem: Es ist unwahrscheinlich, dass herkömmliche Bildanalysemethoden die Daten erfolgreich analysieren können. Techniken wie manuelles Zählen oder Schwellenwerte sind nur dann praktikabel, wenn die Analyse aus einem einzigen Parameter besteht oder wenn mehrere Marker die gleiche Lokalisation haben, bei der nur überlappende Signale gezählt werden. Diese Einschränkung macht die herkömmliche Analyse für die Arbeit mit Datasets mit hohen Parametern ungeeignet. Eine erfolgreiche Analyse dieser Datensätze wurde durch die Segmentierung einzelner Zellen aus histologischen Bildern und die anschließende Durchführung durchflusszytometrischer Gating-ähnlicher Gating-Strategien zur Identifizierung von Zelltypen erreicht^16,17. Ein weiteres Problem, das diese Analysen betrifft, besteht jedoch darin, dass sie nur für Datensätze funktionieren, bei denen alle interessierenden Zellen physisch voneinander getrennt sind, da diese Techniken keine Methoden verwenden, die Zellen, die in physischem Kontakt stehen, genau trennen können. Daher ist eine neuere Methode erforderlich, die Einzelzellanalysen in histologischen Schnitten auch dann durchführen kann, wenn die Zellen in physischem Kontakt stehen.

In diesem Artikel wird ein einfaches Protokoll namens Histoflow-Zytometrie beschrieben, das zuvor eingeführt wurde¹⁸ und das die Anzahl der Fluoreszenzparameter erweitert, die gleichzeitig mit weit verbreiteten Mikroskopen abgebildet werden können. Bei diesem Protokoll werden Gewebe mit spektral überlappenden Farbstoffen gefärbt und dann mit spektraler Kompensation Durchscheinen aus überlappenden Kanälen entfernt, um klare Einzelfärbungen zu erhalten. Um die Analyse von hochparametrischen Histologiebildern zu erleichtern, wird eine detaillierte Analysepipeline beschrieben, die einzelne Zellen aus Gewebeschnitten extrahiert, um Zellen mit Hilfe von Durchflusszytometrie-ähnlichen Gating-Strategien in unterschiedliche Populationen zu sortieren. Dieses Protokoll funktioniert in Geweben, in denen Zellen diffus vorhanden sind, und in Geweben, in denen Zellen eng miteinander verdichtet sind, was diese Technik vielseitig für die Untersuchung von Geweben wie dem ZNS sowohl in der Homöostase als auch in der Neuroinflammation macht. Die Histoflow-Zytometrie ist daher eine nützliche Technik zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen komplexen Zelltypen, die mehrere Zellmarker benötigen, um Zellen zu definieren und gleichzeitig räumliche Informationen zu erhalten.