Génération et analyse d’images histologiques à paramètres élevés avec la cytométrie en flux histologique

L’inflammation provoquée par les cellules du système immunitaire et les cellules gliales peut contribuer à des troubles chroniques du SNC où chaque population peut favoriser l’activité de l’autre ^1,2,3. Comprendre comment le système immunitaire interagit avec ces éléments du SNC pour favoriser l’inflammation du SNC est actuellement un sujet d’intérêt majeur et a été grandement facilité par des techniques à paramètres élevés telles que le séquençage de l’ARN unicellulaire. Grâce au séquençage de l’ARN unicellulaire, nous avons découvert qu’il existe une communication étendue entre les cellules gliales et le système immunitaire dans plusieurs troubles du SNC ^4,5,6. Comprendre comment ces interactions affectent ces troubles sera crucial pour élucider la biologie de ces maladies.

L’un des problèmes avec les analyses de séquençage de cellules uniques est que ces techniques nécessitent que le tissu soit perturbé pour obtenir des cellules ou des noyaux uniques, ce qui entraîne une perte complète d’informations spatiales. Savoir où se trouve une cellule dans un tissu est essentiel pour comprendre le rôle de la cellule dans l’inflammation. Par exemple, les cellules immunitaires telles que les lymphocytes B peuvent se concentrer dans le SNC pendant la neuroinflammation ; cependant, ils pénètrent rarement dans le parenchyme du SNC et se concentrent plutôt dans les barrières du SNC⁷. Compte tenu de leur localisation, il est peu probable que ces cellules contribuent à l’inflammation du SNC en interagissant physiquement avec les cellules gliales du parenchyme du SNC, ce qui suggère que toute interaction qu’elles pourraient avoir avec les cellules gliales se produirait par le biais de facteurs sécrétés. De plus, la pathologie qui se produit dans les troubles du SNC a souvent une structure ^8,9 telle que la localisation d’une cellule dans le tissu pourrait déterminer de manière critique si elle contribue activement au trouble ou si elle est un spectateur. Ainsi, l’utilisation de l’orientation spatiale pour évaluer le rôle d’une cellule dans la pathologie est essentielle.

L’étude des cellules dans les tissus a généralement été réalisée à l’aide de l’immunohistochimie ou de la microscopie à fluorescence immunitaire. Un problème avec ces techniques est qu’elles ne peuvent généralement imager que jusqu’à quatre paramètres simultanément. Il s’agit d’une limitation majeure de ces techniques, car nous savons, grâce à la cytométrie en flux et aux analyses de séquençage de l’ARN unicellulaire, que de nombreuses populations cellulaires nécessitent deux paramètres ou plus pour leur identification ; En outre, le nombre de paramètres requis augmente généralement lors de la recherche de sous-ensembles spécifiques d’un type^{de cellule 10}. Ainsi, il n’est pas pratique d’utiliser des techniques d’imagerie standard pour étudier comment des sous-ensembles de cellules peuvent interagir au sein d’un tissu.

Ce problème a été partiellement surmonté grâce à de nouvelles méthodes à paramètres élevés qui peuvent conserver des informations spatiales, telles que le séquençage spatial de l’ARN¹¹ et l’imagerie par cytométrie de masse¹². Bien que ces techniques soient précieuses, elles présentent plusieurs problèmes, tels que le fait qu’elles ne sont pas largement disponibles, qu’elles réduisent les données tridimensionnelles en deux dimensions et qu’elles nécessitent une expertise considérable pour être exécutées. Une autre technique connue sous le nom de coloration séquentielle, dans laquelle les tissus sont colorés avec un ensemble d’anticorps suivi de l’inactivation de l’ensemble précédent d’anticorps avant la coloration avec un autre ensemble d’anticorps, peut obtenir une histologie à paramètres élevés sans avoir besoin d’équipement spécialisé ou d’expertise 13,14,15 . Cependant, la coloration séquentielle peut être extrêmement laborieuse et nécessite beaucoup de temps de microscopie, ce qui peut être peu pratique pour les laboratoires qui ne possèdent pas de microscope personnel. Par conséquent, il est nécessaire de mettre au point des techniques capables d’augmenter le nombre de paramètres fluorescents pouvant être imagés en même temps sur des microscopes largement disponibles et en temps opportun.

Une fois les données à paramètres élevés acquises, un autre problème se pose : les méthodes d’analyse d’images conventionnelles ont peu de chances d’analyser avec succès les données. Des techniques telles que le comptage manuel ou le seuillage ne sont viables que si l’analyse consiste en un seul paramètre ou si plusieurs marqueurs ont la même localisation où seuls les signaux qui se chevauchent sont comptés. Cette limitation rend l’analyse traditionnelle inadéquate pour travailler avec des ensembles de données à paramètres élevés. L’analyse réussie de ces ensembles de données a été réalisée en segmentant des cellules uniques à partir d’images histologiques, puis en mettant en œuvre des stratégies de contrôle de type cytométrie en flux pour identifier les types de cellules^16,17. Cependant, un autre problème qui affecte ces analyses est qu’elles ne fonctionnent que pour des ensembles de données dans lesquels toutes les cellules d’intérêt sont physiquement séparées les unes des autres, car ces techniques n’utilisent pas de méthodes capables de séparer avec précision les cellules en contact physique. Ainsi, une méthode plus récente est nécessaire pour effectuer des analyses de cellules uniques sur des coupes histologiques même si les cellules sont en contact physique.

Dans cet article, nous décrivons un protocole simple appelé cytométrie histoflux, qui a déjà été introduit¹⁸ et qui augmente le nombre de paramètres fluorescents pouvant être imagés simultanément à l’aide de microscopes largement disponibles. Ce protocole fonctionne en colorant les tissus avec des colorants qui se chevauchent spectralement, puis en utilisant la compensation spectrale pour éliminer le saignement des canaux qui se chevauchent afin d’obtenir des colorants uniques clairs. Pour faciliter l’analyse d’images histologiques à paramètres élevés, un pipeline d’analyse détaillé est décrit qui extrait des cellules uniques de coupes de tissus dans le but de trier les cellules en populations distinctes à l’aide de stratégies de type cytométrie en flux. Ce protocole fonctionne dans les tissus où les cellules sont présentes de manière diffuse et dans les tissus où les cellules sont étroitement compactées les unes contre les autres, ce qui rend cette technique polyvalente pour l’étude de tissus comme le SNC dans l’homéostasie et la neuroinflammation. La cytométrie histoflux est donc une technique utile pour étudier les interactions entre des types de cellules complexes qui nécessitent plusieurs marqueurs cellulaires pour définir les cellules tout en conservant des informations spatiales.