Histologiebeelden met hoge parameters genereren en analyseren met histoflowcytometrie

Ontsteking veroorzaakt door cellen van het immuunsysteem en gliacellen kan bijdragen aan chronische aandoeningen van het CZS, waarbij elke populatie de activiteit van de andere^{kan bevorderen 1,2,3}. Begrijpen hoe het immuunsysteem interageert met deze elementen van het CZS om CZS-ontsteking te bevorderen, is momenteel een belangrijk onderwerp van interesse en is enorm vergemakkelijkt door technieken met hoge parameters, zoals single-cell RNA-sequencing. Door middel van single-cell RNA-sequencing hebben we ontdekt dat er uitgebreide communicatie plaatsvindt tussen gliacellen en het immuunsysteem bij verschillende CZS-aandoeningen ^4,5,6. Begrijpen hoe deze interacties deze aandoeningen beïnvloeden, zal cruciaal zijn om de biologie van deze ziekten op te helderen.

Een probleem met single-cell sequencing-analyses is dat deze technieken vereisen dat het weefsel wordt verstoord om enkele cellen of kernen te verkrijgen, wat resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke informatie. Weten waar een cel zich in een weefsel bevindt, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de rol van de cel bij het veroorzaken van ontstekingen. Immuuncellen zoals B-cellen kunnen zich bijvoorbeeld concentreren in het CZS tijdens neuro-inflammatie; ze komen echter zelden in het CZS-parenchym terecht en concentreren zich in plaats daarvan in CZS-barrières⁷. Gezien hun lokalisatie is het onwaarschijnlijk dat deze cellen bijdragen aan CZS-ontsteking door fysieke interactie met gliacellen in het CZS-parenchym, wat suggereert dat eventuele interacties die ze mogelijk hebben met gliacellen zouden plaatsvinden via uitgescheiden factoren. Bovendien heeft de pathologie die optreedt bij CZS-aandoeningen vaak structuur ^8,9 zodat de lokalisatie van een cel in het weefsel kritisch kan bepalen of deze actief bijdraagt aan de aandoening of een omstander is. Het gebruik van ruimtelijke oriëntatie om de rol van een cel in de pathologie te evalueren is dus essentieel.

Het bestuderen van cellen in weefsel is meestal bereikt met behulp van immunohistochemie of immuunfluorescentiemicroscopie. Een probleem met deze technieken is dat ze doorgaans slechts maximaal vier parameters tegelijk kunnen weergeven. Dit is een belangrijke beperking van deze technieken, aangezien we weten uit flowcytometrie en single-cell RNA-sequencinganalyses dat veel celpopulaties twee of meer parameters nodig hebben voor hun identificatie; Ook neemt het aantal vereiste parameters doorgaans toe bij het zoeken naar specifieke subsets van een celtype¹⁰. Het is dus onpraktisch om standaard beeldvormingstechnieken te gebruiken om te bestuderen hoe subsets van cellen in een weefsel op elkaar kunnen inwerken.

Dit probleem is gedeeltelijk verholpen door nieuwere methoden met hoge parameters die ruimtelijke informatie kunnen behouden, zoals ruimtelijke RNA-sequencing¹¹ en beeldvorming massacytometrie¹². Hoewel deze technieken waardevol zijn, hebben ze verschillende problemen, zoals het feit dat ze niet algemeen beschikbaar zijn, driedimensionale gegevens in twee dimensies reduceren en aanzienlijke expertise vereisen om uit te voeren. Een andere techniek die bekend staat als sequentiële kleuring, waarbij weefsels worden gekleurd met een set antilichamen gevolgd door inactivering van de vorige set antilichamen voordat ze worden gekleurd met een andere set antilichamen, kan histologie met hoge parameters bereiken zonder dat er gespecialiseerde apparatuur of expertise nodig is 13,14,15. Sequentiële kleuring kan echter extreem arbeidsintensief zijn en vereist een grote hoeveelheid microscopietijd, wat onpraktisch kan zijn voor laboratoria die geen persoonlijke microscoop bezitten. Er is dus behoefte aan technieken die het aantal fluorescerende parameters kunnen uitbreiden dat in één keer kan worden afgebeeld op microscopen die algemeen en tijdig beschikbaar zijn.

Zodra de gegevens met hoge parameters zijn verkregen, doet zich een ander probleem voor: het is onwaarschijnlijk dat conventionele beeldanalysemethoden de gegevens met succes zullen analyseren. Technieken zoals handmatig tellen of drempelwaarden zijn alleen levensvatbaar als de analyse bestaat uit een enkele parameter of als meerdere markers dezelfde lokalisatie hebben waarbij alleen overlappende signalen worden geteld. Deze beperking maakt traditionele analyse ontoereikend om te werken met datasets met hoge parameters. Succesvolle analyse van deze datasets is bereikt door afzonderlijke cellen uit histologiebeelden te segmenteren en vervolgens flowcytometrie-achtige gatingstrategieën uit te voeren om celtypen te identificeren^16,17. Een ander probleem dat van invloed is op deze analyses is echter dat ze alleen werken voor datasets waarin alle cellen van belang fysiek van elkaar zijn gescheiden, aangezien deze technieken geen methoden gebruiken die cellen die fysiek contact maken nauwkeurig kunnen scheiden. Er is dus een nieuwere methode nodig die analyses van één cel kan uitvoeren op histologiesecties, zelfs als de cellen fysiek contact hebben.

In dit artikel wordt een eenvoudig protocol beschreven, histoflowcytometrie genaamd, dat eerder is geïntroduceerd¹⁸ en dat het aantal fluorescerende parameters uitbreidt dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld met behulp van algemeen beschikbare microscopen. Dit protocol werkt door weefsels te kleuren met spectraal overlappende kleurstoffen en vervolgens spectrale compensatie te gebruiken om doorbloedingen van overlappende kanalen te verwijderen om heldere enkelvoudige vlekken te verkrijgen. Om de analyse van histologiebeelden met hoge parameters te vergemakkelijken, wordt een gedetailleerde analysepijplijn beschreven die afzonderlijke cellen uit weefselsecties extraheert met het oog op het sorteren van cellen in verschillende populaties met behulp van flowcytometrie-achtige gatingstrategieën. Dit protocol werkt in weefsels waar cellen diffuus aanwezig zijn en in weefsels waar cellen dicht op elkaar zijn verdicht, waardoor deze techniek veelzijdig is voor de studie van weefsels zoals het CZS bij zowel homeostase als neuro-inflammatie. Histoflowcytometrie is daarom een nuttige techniek voor het bestuderen van interacties tussen complexe celtypen die meerdere celmarkers nodig hebben om cellen te definiëren met behoud van ruimtelijke informatie.