Gerando e analisando imagens histológicas de alto parâmetro com citometria de histofluxo

A inflamação impulsionada por células do sistema imunológico e células gliais pode contribuir para distúrbios crônicos do SNC, onde cada população pode promover a atividade da outra ^1,2,3. Compreender como o sistema imunológico interage com esses elementos do SNC para promover a inflamação do SNC é atualmente um grande tópico de interesse e tem sido muito facilitado por técnicas de alto parâmetro, como o sequenciamento de RNA de célula única. Por meio do sequenciamento de RNA de célula única, descobrimos que há uma extensa comunicação ocorrendo entre as células gliais e o sistema imunológico em vários distúrbios do SNC ^4,5,6. Entender como essas interações estão afetando esses distúrbios será crucial para elucidar a biologia dessas doenças.

Um problema com as análises de sequenciamento de célula única é que essas técnicas exigem que o tecido seja interrompido para obter células ou núcleos únicos, resultando em uma perda completa de informações espaciais. Saber onde uma célula existe em um tecido é fundamental para entender o papel da célula na condução da inflamação. Por exemplo, células imunes, como células B, podem se concentrar no SNC durante a neuroinflamação; no entanto, raramente entram no parênquima do SNC e, em vez disso, concentram-se nas barreiras do SNC⁷. Dada a sua localização, é improvável que essas células contribuam para a inflamação do SNC interagindo fisicamente com as células gliais no parênquima do SNC, sugerindo que quaisquer interações que possam estar tendo com as células gliais ocorreriam por meio de fatores secretados. Além disso, a patologia que ocorre nos distúrbios do SNC geralmente tem estrutura ^8,9 de modo que a localização de uma célula no tecido pode determinar criticamente se ela está contribuindo ativamente para o distúrbio ou se é um espectador. Assim, o uso da orientação espacial para avaliar o papel de uma célula na patologia é essencial.

O estudo de células no tecido geralmente é realizado usando imuno-histoquímica ou microscopia de imunofluorescência. Um problema com essas técnicas é que elas normalmente só podem gerar imagens de até quatro parâmetros simultaneamente. Esta é uma grande limitação para essas técnicas, pois sabemos por citometria de fluxo e análises de sequenciamento de RNA de célula única que muitas populações de células requerem dois ou mais parâmetros para sua identificação; Além disso, o número de parâmetros necessários normalmente aumenta ao procurar subconjuntos específicos de um tipo de célula¹⁰. Assim, é impraticável usar técnicas de imagem padrão para estudar como subconjuntos de células podem estar interagindo dentro de um tecido.

Esse problema foi parcialmente superado por meio de métodos mais recentes de alto parâmetro que podem reter informações espaciais, como sequenciamento espacial de RNA¹¹ e citometria de massa de imagem¹². Embora essas técnicas sejam valiosas, elas têm vários problemas, como não estarem amplamente disponíveis, reduzir os dados tridimensionais em duas dimensões e exigir uma experiência considerável para serem executadas. Outra técnica conhecida como coloração sequencial, em que os tecidos são corados com um conjunto de anticorpos seguido pela inativação do conjunto anterior de anticorpos antes da coloração com outro conjunto de anticorpos, pode atingir histologia de alto parâmetro sem a necessidade de equipamento especializado ou experiência 13,14,15. No entanto, a coloração sequencial pode ser extremamente trabalhosa e requer uma grande quantidade de tempo de microscopia, o que pode ser impraticável para laboratórios que não possuem um microscópio pessoal. Assim, há uma necessidade de técnicas que possam expandir o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados de uma só vez em microscópios amplamente disponíveis e em tempo hábil.

Uma vez que os dados de alto parâmetro tenham sido adquiridos, surge outro problema: é improvável que os métodos convencionais de análise de imagem analisem os dados com sucesso. Técnicas como contagem manual ou limiar só são viáveis se a análise consistir em um único parâmetro ou se vários marcadores tiverem a mesma localização onde apenas sinais sobrepostos são contados. Essa limitação torna a análise tradicional inadequada para trabalhar com conjuntos de dados de alto parâmetro. A análise bem-sucedida desses conjuntos de dados foi alcançada segmentando células únicas de imagens histológicas e, em seguida, conduzindo estratégias de bloqueio semelhantes à citometria de fluxo para identificar tipos de células^16,17. No entanto, outra questão que afeta essas análises é que elas funcionam apenas para conjuntos de dados em que todas as células de interesse estão fisicamente separadas umas das outras, pois essas técnicas não empregam métodos que possam separar com precisão as células que estão em contato físico. Assim, é necessário um método mais recente que possa realizar análises de células únicas em seções histológicas, mesmo que as células estejam em contato físico.

Neste artigo, é descrito um protocolo simples chamado citometria de histofluxo, que foi introduzido anteriormente¹⁸ , que expande o número de parâmetros fluorescentes que podem ser visualizados simultaneamente usando microscópios amplamente disponíveis. Este protocolo funciona colorindo tecidos com corantes espectralmente sobrepostos e, em seguida, usando compensação espectral para remover o sangramento de canais sobrepostos para obter manchas únicas claras. Para facilitar a análise de imagens histológicas de alto parâmetro, é descrito um pipeline de análise detalhado que extrai células únicas de seções de tecido com o objetivo de classificar células em populações distintas usando estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo. Este protocolo funciona em tecidos onde as células estão difusamente presentes e em tecidos onde as células estão compactadas, tornando esta técnica versátil para o estudo de tecidos como o SNC tanto na homeostase quanto na neuroinflamação. A citometria de histofluxo é, portanto, uma técnica útil para estudar interações entre tipos de células complexas que requerem vários marcadores celulares para definir as células, mantendo as informações espaciais.