توليد وتحليل صور الأنسجة عالية المعلمات باستخدام قياس التدفق الخلوي

يمكن أن يساهم الالتهاب الناجم عن خلايا الجهاز المناعي والخلايا الدبقية في الاضطرابات المزمنة في الجهاز العصبي المركزي حيث يمكن لكل مجموعة تعزيز نشاط^1،2،3 الأخرى. إن فهم كيفية تفاعل الجهاز المناعي مع هذه العناصر من الجهاز العصبي المركزي لتعزيز التهاب الجهاز العصبي المركزي هو حاليا موضوع رئيسي للاهتمام وقد تم تسهيله إلى حد كبير من خلال التقنيات عالية المعلمات مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، اكتشفنا أن هناك اتصالا مكثفا يحدث بين الخلايا الدبقية والجهاز المناعي في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي^4،5،6. إن فهم كيفية تأثير هذه التفاعلات على هذه الاضطرابات سيكون أمرا حاسما لتوضيح بيولوجيا هذه الأمراض.

تتمثل إحدى مشكلات تحليلات تسلسل الخلية الواحدة في أن هذه التقنيات تتطلب تعطيل الأنسجة للحصول على خلايا أو نوى مفردة ، مما يؤدي إلى فقدان كامل للمعلومات المكانية. إن معرفة مكان وجود الخلية في الأنسجة أمر بالغ الأهمية لفهم دور الخلية في تحفيز الالتهاب. على سبيل المثال ، يمكن للخلايا المناعية مثل الخلايا البائية التركيز في الجهاز العصبي المركزي أثناء الالتهاب العصبي. ومع ذلك ، نادرا ما تدخل حمة الجهاز العصبي المركزي وبدلا من ذلك تركز في حواجز الجهاز العصبي^{المركزي 7}. نظرا لتوطينها ، فمن غير المحتمل أن تساهم هذه الخلايا في التهاب الجهاز العصبي المركزي من خلال التفاعل جسديا مع الخلايا الدبقية في حمة الجهاز العصبي المركزي ، مما يشير إلى أن أي تفاعلات قد تكون مع الخلايا الدبقية ستحدث من خلال عوامل مفرزة. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لعلم الأمراض الذي يحدث في اضطرابات الجهاز العصبي المركزي بنية ^8,9 بحيث يمكن لتوطين الخلية في الأنسجة أن يحدد بشكل حاسم ما إذا كانت تساهم بنشاط في الاضطراب أو أنها متفرج. وبالتالي ، فإن استخدام التوجه المكاني لتقييم دور الخلية في علم الأمراض أمر ضروري.

عادة ما يتم إنجاز دراسة الخلايا في الأنسجة باستخدام الكيمياء الهيستولوجية المناعية أو الفحص المجهري المناعي. تكمن مشكلة هذه التقنيات في أنها عادة ما يمكنها فقط تصوير ما يصل إلى أربعة معلمات في وقت واحد. وهذا قيد رئيسي على هذه التقنيات، كما نعلم من تحليلات قياس التدفق الخلوي وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية أن العديد من مجموعات الخلايا تتطلب معلمتين أو أكثر لتحديدها؛ أيضا ، يزداد عدد المعلمات المطلوبة عادة عند البحث عن مجموعات فرعية محددة من نوع الخلية¹⁰. وبالتالي ، من غير العملي استخدام تقنيات التصوير القياسية لدراسة كيفية تفاعل مجموعات فرعية من الخلايا داخل الأنسجة.

تم التغلب على هذه المشكلة جزئيا من خلال طرق أحدث عالية المعلمات يمكنها الاحتفاظ بالمعلومات المكانية ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي المكاني¹¹ وتصوير قياس الكتلة^{الخلوية 12}. في حين أن هذه التقنيات ذات قيمة ، إلا أنها تواجه العديد من المشكلات ، مثل عدم توفرها على نطاق واسع ، وتقليل البيانات ثلاثية الأبعاد إلى بعدين ، وتتطلب خبرة كبيرة للتنفيذ. تقنية أخرى تعرف باسم التلوين المتسلسل ، حيث يتم تلطيخ الأنسجة بمجموعة واحدة من الأجسام المضادة متبوعة بتعطيل المجموعة السابقة من الأجسام المضادة قبل تلطيخها بمجموعة أخرى من الأجسام المضادة ، يمكن أن تحقق أنسجة عالية المعلمات دون الحاجة إلى معدات أو خبرة متخصصة^13،14،15. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التلوين المتسلسل كثيف العمالة ويتطلب قدرا كبيرا من وقت الفحص المجهري ، والذي قد يكون غير عملي للمختبرات التي لا تمتلك مجهرا شخصيا. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تقنيات يمكنها زيادة عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد على المجاهر المتاحة على نطاق واسع وفي الوقت المناسب.

بمجرد الحصول على البيانات عالية المعلمات ، تنشأ مشكلة أخرى: من غير المرجح أن تقوم طرق تحليل الصور التقليدية بتحليل البيانات بنجاح. لا تكون تقنيات مثل العد اليدوي أو العتبة قابلة للتطبيق إلا إذا كان التحليل يتكون من معلمة واحدة أو إذا كانت العلامات المتعددة لها نفس التوطين حيث يتم حساب الإشارات المتداخلة فقط. هذا القيد يجعل التحليل التقليدي غير كاف للعمل مع مجموعات البيانات عالية المعلمات. تم تحقيق تحليل ناجح لمجموعات البيانات هذه من خلال تقسيم الخلايا المفردة من صور الأنسجة ثم إجراء استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي لتحديد أنواع الخلايا^16,17. ومع ذلك ، هناك مشكلة أخرى تؤثر على هذه التحليلات وهي أنها تعمل فقط مع مجموعات البيانات حيث يتم فصل جميع الخلايا ذات الأهمية ماديا عن بعضها البعض ، لأن هذه التقنيات لا تستخدم طرقا يمكنها فصل الخلايا التي هي على اتصال جسدي بدقة. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة أحدث يمكنها إجراء تحليلات خلية واحدة على أقسام الأنسجة حتى لو كانت الخلايا على اتصال جسدي.

في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول بسيط يسمى قياس التدفق الخلوي النسيجي الذي تم تقديمه سابقا¹⁸ والذي يوسع عدد المعلمات الفلورية التي يمكن تصويرها في وقت واحد باستخدام المجاهر المتاحة على نطاق واسع. يعمل هذا البروتوكول عن طريق تلطيخ الأنسجة بأصباغ متداخلة طيفيا ثم استخدام التعويض الطيفي لإزالة النزيف من القنوات المتداخلة للحصول على بقع مفردة واضحة. لتسهيل تحليل صور الأنسجة عالية المعلمات ، يتم وصف خط أنابيب تحليل مفصل يستخرج الخلايا المفردة من أقسام الأنسجة لغرض فرز الخلايا إلى مجموعات متميزة باستخدام استراتيجيات بوابات تشبه قياس التدفق الخلوي. يعمل هذا البروتوكول في الأنسجة التي توجد فيها الخلايا بشكل منتشر وفي الأنسجة التي تضغط فيها الخلايا معا بشكل وثيق، مما يجعل هذه التقنية متعددة الاستخدامات لدراسة الأنسجة مثل الجهاز العصبي المركزي في كل من الاتزان الداخلي والالتهاب العصبي. وبالتالي ، فإن قياس التدفق الخلوي النسيجي هو تقنية مفيدة لدراسة التفاعلات بين أنواع الخلايا المعقدة التي تتطلب علامات خلايا متعددة لتحديد الخلايا مع الحفاظ على المعلومات المكانية.