הפקה וניתוח של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow
Summary
המתוארת כאן היא שיטה שניתן להשתמש בה כדי לצלם חמישה פרמטרים פלואורסצנטיים או יותר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent. מתואר צינור ניתוח לחילוץ תאים בודדים מתמונות אלה ולביצוע אנליזה של תא בודד באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה, אשר יכולות לזהות תת-קבוצות תאים במקטעי רקמות.
Abstract
השימוש בהיסטולוגיה כדי לחקור את מגוון תאי החיסון בחלקי רקמות, כגון אלה הנגזרים ממערכת העצבים המרכזית (CNS), מוגבל באופן קריטי על ידי מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם בו זמנית. רוב תת-הקבוצות של תאי מערכת החיסון הוגדרו באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות שילובים מורכבים של סמני חלבון, שלעתים קרובות דורשים ארבעה פרמטרים או יותר כדי לזהות באופן חד-משמעי, וזה מעבר ליכולות של רוב המיקרוסקופים הקונבנציונליים. כאשר ציטומטריית זרימה מנתקת רקמות ומאבדת מידע מרחבי, יש צורך בטכניקות שיכולות לשמור מידע מרחבי תוך חקירת תפקידיהם של סוגי תאים מורכבים. בעיות אלה מטופלות כאן על ידי יצירת שיטה להרחבת מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם על ידי איסוף האותות של פלואורופורים חופפים ספקטרלית ושימוש בפירוק ספקטרלי כדי להפריד את האותות של כל פלואורופור בודד. תמונות אלה מעובדות לאחר מכן באמצעות צינור ניתוח כדי לצלם תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים ולחלץ תאים בודדים מתמונות אלה, כך שניתן יהיה לנתח את התכונות הפלואורסצנטיות הייחודיות של כל תא ברמת תא יחיד. באמצעות שימוש באסטרטגיות gating דמויות ציטומטריית זרימה, ניתן ליצור פרופיל של תאים לתת-קבוצות ולמפות אותם בחזרה לקטעי ההיסטולוגיה כדי לא רק לכמת את השפע שלהם, אלא גם לקבוע כיצד הם מתקשרים עם סביבת הרקמה. בסך הכל, הודגמה הפשטות והפוטנציאל של שימוש בציטומטריה של היסטופלואו לחקר אוכלוסיות חיסוניות מורכבות במדורי היסטולוגיה.
Introduction
דלקת המונעת על ידי תאים של מערכת החיסון ותאי גלייה יכולה לתרום להפרעות כרוניות של מערכת העצבים המרכזית, כאשר כל אוכלוסייה יכולה לקדם את הפעילות של 1,2,3 האחרים. הבנת האופן שבו מערכת החיסון מתקשרת עם אלמנטים אלה של מערכת העצבים המרכזית כדי לקדם דלקת במערכת העצבים המרכזית היא כיום נושא מרכזי של עניין, וזה כבר הקל מאוד על ידי טכניקות פרמטרים גבוהים כגון ריצוף RNA תא יחיד. באמצעות ריצוף RNA חד-תאי, גילינו כי קיימת תקשורת נרחבת בין תאי גלייה לבין מערכת החיסון במספר הפרעות במערכת העצבים המרכזית 4,5,6. הבנת האופן שבו אינטראקציות אלה משפיעות על הפרעות אלה תהיה חיונית להבהרת הביולוגיה של מחלות אלה.
בעיה אחת עם ניתוחי ריצוף של תא בודד היא שטכניקות אלה דורשות לשבש את הרקמה כדי להשיג תאים בודדים או גרעינים, וכתוצאה מכך אובדן מוחלט של מידע מרחבי. הידיעה היכן תא קיים ברקמה היא קריטית להבנת תפקידו של התא בהנעת דלקת. לדוגמה, תאים חיסוניים כגון תאי B יכולים להתרכז במערכת העצבים המרכזית במהלך דלקת עצבית; עם זאת, לעתים רחוקות הם נכנסים לפרנכימה של מערכת העצבים המרכזית ובמקום זאת מתרכזים במחסומי CNS7. בהתחשב בלוקליזציה שלהם, אין זה סביר כי תאים אלה תורמים דלקת CNS על ידי אינטראקציה פיזית עם תאי גליה בפרנכימה CNS, דבר המצביע על כך שכל אינטראקציה שהם עשויים לקיים עם תאי גליה תתרחש באמצעות גורמים מופרשים. בנוסף, הפתולוגיה המתרחשת בהפרעות CNS לעתים קרובות יש מבנה 8,9 כך המיקום של התא ברקמה יכול לקבוע באופן קריטי אם הוא תורם באופן פעיל להפרעה או הוא צופה מהצד. לפיכך, השימוש באוריינטציה מרחבית כדי להעריך את תפקידו של התא בפתולוגיה הוא חיוני.
חקר תאים ברקמה נעשה בדרך כלל באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מערכת החיסון. בעיה עם טכניקות אלה היא שהן בדרך כלל יכולות לדמיין רק עד ארבעה פרמטרים בו זמנית. זוהי מגבלה משמעותית לטכניקות אלה, כפי שאנו יודעים מציטומטריית זרימה ומניתוחי ריצוף RNA של תא בודד כי אוכלוסיות תאים רבות דורשות שני פרמטרים או יותר לזיהוין; כמו כן, מספר הפרמטרים הנדרשים בדרך כלל גדל כאשר מחפשים תת-קבוצות ספציפיות של סוג תא10. לכן, אין זה מעשי להשתמש בטכניקות הדמיה סטנדרטיות כדי לחקור כיצד תת-קבוצות של תאים עשויות לקיים אינטראקציה בתוך רקמה.
בעיה זו נפתרה חלקית באמצעות שיטות חדשות יותר בעלות פרמטרים גבוהים שיכולות לשמור מידע מרחבי, כגון ריצוף RNA מרחבי11 וציטומטריית מסה12. בעוד טכניקות אלה הן בעלות ערך, יש להם כמה בעיות, כגון לא להיות זמין באופן נרחב, צמצום נתונים תלת מימדיים לשני ממדים, ודורש מומחיות רבה לבצע. טכניקה נוספת המכונה צביעה רציפה, שבה רקמות מוכתמות עם קבוצה אחת של נוגדנים ואחריו השבתה של קבוצה קודמת של נוגדנים לפני צביעה עם קבוצה אחרת של נוגדנים, יכול להשיג היסטולוגיה פרמטרים גבוהים ללא צורך בציוד מיוחד או מומחיות 13,14,15. עם זאת, צביעה רציפה יכולה להיות אינטנסיבית מאוד עבודה ודורשת כמות גדולה של זמן מיקרוסקופיה, אשר עשוי להיות לא מעשי עבור מעבדות שאין בבעלותן מיקרוסקופ אישי. לכן, יש צורך בטכניקות שיכולות להרחיב את מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם בו זמנית על מיקרוסקופים הזמינים באופן נרחב ובזמן.
לאחר רכישת הנתונים בעלי הפרמטרים הגבוהים, מתעוררת בעיה נוספת: שיטות ניתוח תמונה קונבנציונליות לא צפויות לנתח בהצלחה את הנתונים. טכניקות כגון ספירה ידנית או סף הן בנות קיימא רק אם הניתוח מורכב מפרמטר יחיד או אם לסמנים מרובים יש לוקליזציה זהה שבה נספרים רק אותות חופפים. מגבלה זו הופכת את הניתוח המסורתי לבלתי מספק לעבודה עם מערכי נתונים בעלי פרמטרים גבוהים. ניתוח מוצלח של מערכי נתונים אלה הושג על ידי פילוח תאים בודדים מתמונות היסטולוגיה ולאחר מכן ביצוע אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריית זרימה כדי לזהות סוגי תאים16,17. עם זאת, בעיה נוספת המשפיעה על ניתוחים אלה היא שהם עובדים רק עבור מערכי נתונים שבהם כל התאים המעניינים מופרדים פיזית זה מזה, שכן טכניקות אלה אינן משתמשות בשיטות שיכולות להפריד במדויק תאים הנמצאים במגע פיזי. לכן, נדרשת שיטה חדשה יותר שיכולה לבצע אנליזות של תא בודד על קטעי היסטולוגיה גם אם התאים נמצאים במגע פיזי.
במאמר זה מתואר פרוטוקול פשוט שנקרא ציטומטריה היסטופלואו שהוצג בעבר18 המרחיב את מספר הפרמטרים הפלואורסצנטיים שניתן לצלם בו זמנית באמצעות מיקרוסקופים זמינים באופן נרחב. פרוטוקול זה פועל על ידי צביעת רקמות בצבעים חופפים ספקטרלית ולאחר מכן שימוש בפיצוי ספקטרלי כדי להסיר דימום מתעלות חופפות לקבלת כתמים בודדים ברורים. כדי להקל על ניתוח תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים, מתואר צינור ניתוח מפורט המחלץ תאים בודדים מקטעי רקמה לצורך מיון תאים לאוכלוסיות נפרדות באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקול זה פועל ברקמות שבהן תאים נמצאים באופן מפוזר וברקמות שבהן תאים דחוסים זה לזה, מה שהופך את הטכניקה הזו לרב-תכליתית לחקר רקמות כמו מערכת העצבים המרכזית הן בהומאוסטזיס והן בדלקת עצבית. הציטומטריה של היסטופלואו היא, אם כן, טכניקה שימושית לחקר אינטראקציות בין סוגי תאים מורכבים הדורשים סמני תאים מרובים כדי להגדיר תאים תוך שמירה על מידע מרחבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מתואר השימוש בציטומטריה של היסטופלו, טכניקה שאומתה בעבר18. הוכח כי בעת צביעת קטעי רקמה בצבעים חופפים ספקטרלית, ניתן להסיר את הדימום דרך ערוצים באמצעות פיצוי ספקטרלי, וכתוצאה מכך מספר רב יותר של פרמטרים פלואורסצנטיים נפתרים בבירור מאשר בדרך כלל מתאפשר בשיטות קונבנציונליות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לפלטפורמה המתקדמת למיקרוסקופיה של מכון המוח הוצ’קיס על תשתית הדימות והמומחיות. RWJ נתמך על ידי מימון מלגות פוסט-דוקטורט מתוכנית Eyes High של אוניברסיטת קלגרי ועל ידי האגודה לטרשת נפוצה של קנדה ומלגת רוש קנדה ללא הגבלה. VWY קיבלה תמיכה בשכר מתוכנית Canada Research Chair Tier 1. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות תפעול של מענק מחקר הבריאות של המכונים הקנדיים 1049959, מענק 3236 של האגודה לטרשת נפוצה של קנדה, ומשרד ההגנה האמריקאי של תוכנית המחקר לטרשת נפוצה המכוונת על ידי הקונגרס. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com. הנתונים המותאמים בפרסום זה פורסמו במקור בכתב העת Journal of Immunology. רג’יב ו. ג’יין, דייוויד א. אליוט וו. ווי יונג. 2023. ניתוח תא בודד של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow. י. אימונול. 210: 2038-2049. זכויות יוצרים © [2023]. האגודה האמריקאית לאימונולוגים, Inc.
Materials
| 100% Ethanol | Sigma | 676829-1L | |
| 4% PFA | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | |
| Anaconda | N/A | N/A | https://www.anaconda.com/download |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A4503-50G | |
| Cold fish stain gelatin | Sigma | G7765 | |
| Collating multichannel data from Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Convert FlowJo output to txt file for Cell selection in Imaris.ipynb script | N/A | N/A | https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis- |
| Donkey anti-rat Alexa Fluor 647 | JacksonImmunoResearch | 712-605-153 | 1:300 concentration |
| Donkey anti-rat DyLight 405 | Jackson ImmunoResearch | 712-475-153 | 1:200 concentration |
| Donkey Serum | JacksonImmunoResearch | 017-000-001 | |
| F(ab')2-Goat anti-Mouse IgG PerCP-eFluor 710 | Thermofisher | 46-4010-82 | 1:25 concentration |
| FIJI | N/A | N/A | https://imagej.net/software/fiji/ |
| FlowJo | FlowJo LLC | Software 4 | |
| Fluorescence spectraviewer | https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/ | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Fresh frozen human tonsil sections | amsbio | HF-707 | |
| Glass coverslip | VWR | 48393 106 | |
| Goat anti-human IgA Alexa Fluor 488 | JacksonImmunoResearch | 109-546-011 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgG Cy3 | JacksonImmunoResearch | 709-166-098 | 1:400 concentration |
| Goat anti-human IgM Dylight 405 | JacksonImmunoResearch | 109-476-129 | 1:300 concentration |
| Goat anti-rabbit A546 | Thermo Fisher Scientific | A-11035 | 1:250 concentration |
| Goat anti-rabbit IgG PE-Alexa Fluor 610 | Thermofisher | A-20981 | 1:250 concentration |
| Horse Serum | Sigma | H1138 | |
| Ilastik | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/ |
| Ilastik FIJI plugin | N/A | N/A | https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin |
| Imaris File Converter | Oxford Instruments | Software 2 | |
| Imaris with cell module | Oxford Instruments | Software 3 | |
| kimwipe | Kimtech | 34155 | |
| LasX Life Science software | Leica | Software 1 | |
| Mouse anti-human CD20 | VWR | CA95024-322 | 1:40 concentration |
| Mouse anti-human CD38 APC-R700 | BD Biosciences | 564980 | 1:20 concentration |
| Normal Goat Serum | JacksonImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Normal Mouse Serum | JacksonImmunoResearch | 015-000-001 | |
| Normal Rabbit Serum | JacksonImmunoResearch | 011-000-001 | |
| Normal Rat Serum | JacksonImmunoResearch | 012-000-120 | |
| Nuclear Yellow | Abcam | ab138903 | Dissolve in DMSO at a concentration of 2 mg/ml and store at 4°C in the dark |
| PAP pen | Cedarlane | MU22 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Rabbit anti-human Ki67 | Abcam | ab15580 | 1:500 concentration |
| Rabbit anti-mouse Iba1 | Wako | 019-19741 | 1:500 concentration |
| Rat anti-human Blimp1 | Thermofisher | 14-5963-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse B220 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 103226 | 1:250 concentration |
| Rat anti-mouse CD138 | Biolegend | 142502 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD3 PE-eFluor 610 | Thermo Fisher Scientific | 61-0032-82 | 1:40 concentration |
| Rat anti-mouse CD4 Alexa Fluor 488 | BioLegend | 100529 | 1:200 concentration |
| Rat anti-mouse CD45 allophycocyanin-R700 | BD Biosciences | 565478 | 1:50 concentration |
| Rat anti-mouse IgD PerCP-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5993-82 | 1:50 concentration |
| SP8 Confocal microscope | Leica | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ml | |
| Trueblack | Biotium | 23007 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949-500ml | |
| Ultracomp ebeads | Thermofisher | 01-2222-42 |
References
- Bar-Or, A., Li, R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances. Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).
- Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).
- Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology. Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).
- Absinta, M., et al. A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis. Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Schirmer, L., et al. Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis. Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).
- Jain, R. W., Yong, V. W. B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology. Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).
- Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
- Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. A practitioner’s view of spectral flow cytometry. Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).
- Ramaglia, V., et al. Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry. Elife. 8, (2019).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
- Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies. J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).
- Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry. J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. , (2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Berg, S., et al. ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
- Ruhlandt, D., et al. Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity. Commun Biol. 3 (1), 627 (2020).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. 79, 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Elliott, A. D. Confocal microscopy: Principles and modern practices. Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68 (2020).
- Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy. Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
