Histoflow Cytometryによるハイパラメーター組織像の生成と解析

免疫系の細胞とグリア細胞によって引き起こされる炎症は、各集団^{が他の1,2,3}の活性を促進することができるCNSの慢性障害に寄与する可能性があります。免疫系がCNSのこれらの要素とどのように相互作用してCNSの炎症を促進するかを理解することは、現在主要な関心事であり、シングルセルRNAシーケンシングなどのハイパラメーター技術によって大幅に促進されています。シングルセルRNAシーケンシングを通じて、いくつかのCNS疾患において、グリア細胞と免疫系との間に広範なコミュニケーションが起こっていることを発見しました^4,5,6。これらの相互作用がこれらの疾患にどのように影響しているかを理解することは、これらの疾患の生物学を解明するために非常に重要です。

シングルセルシーケンシング解析の問題点の1つは、これらの技術では、シングルセルまたは核を得るために組織を破壊する必要があり、その結果、空間情報が完全に失われることです。細胞が組織内のどこに存在するかを知ることは、炎症を引き起こす細胞の役割を理解するために重要です。例えば、B細胞などの免疫細胞は、神経炎症中にCNSに集中することができる。しかし、彼らはめったにCNS実質に入ることはなく、代わりにCNSバリア⁷に集中します。その局在性を考えると、これらの細胞がCNS実質のグリア細胞と物理的に相互作用することによってCNS炎症に寄与している可能性は低く、グリア細胞との相互作用は分泌因子を介して起こることが示唆されています。さらに、CNS障害で発生する病理は、多くの場合、組織内での細胞の局在化が、それが障害に積極的に寄与しているのか、それとも傍観者なのかを決定的に判断できるように、構造^8,9を持っています。したがって、病理学における細胞の役割を評価するために空間的オリエンテーションを使用することが不可欠である。

組織中の細胞の研究は、通常、免疫組織化学または免疫蛍光顕微鏡を使用して行われてきました。これらの手法の問題は、通常、同時に最大4つのパラメータしか画像化できないことです。フローサイトメトリーやシングルセルRNAシーケンシング解析から、多くの細胞集団が同定のために2つ以上のパラメータを必要とすることがわかっているため、これはこれらの技術の大きな制限です。また、必要なパラメータの数は、通常、セルタイプ¹⁰の特定のサブセットを探すときに増加します。したがって、細胞のサブセットが組織内でどのように相互作用しているかを研究するために、標準的なイメージング技術を使用することは現実的ではありません。

この問題は、空間的RNAシーケンシング¹¹やイメージングマスサイトメト^リー12など、空間情報を保持できる新しいハイパラメータ法によって部分的に克服されています。これらの手法は価値がありますが、広く利用されていない、3 次元データを 2 次元に縮小する、実行するにはかなりの専門知識が必要になるなど、いくつかの問題があります。逐次染色として知られる別の技術は、組織を1セットの抗体で染色し、続いて前の抗体セットを不活性化してから別の抗体セットで染色するというもので、特殊な機器や専門知識を必要とせずにハイパラメーターの組織型検査を達成できる13,14,15.しかし、逐次染色は非常に手間がかかり、顕微鏡観察に長時間かかるため、個人用顕微鏡を所有していない研究室では実用的ではありません。そのため、広く利用可能な顕微鏡で一度にイメージングできる蛍光パラメータの数をタイムリーに拡大できる技術が求められています。

ハイパラメータデータを取得すると、従来の画像解析方法ではデータの解析がうまくいかないという別の問題が発生します。手動カウントやしきい値処理などの手法は、解析が 1 つのパラメーターで構成されている場合、または複数のマーカーが同じ位置を特定し、重複する信号のみがカウントされる場合にのみ実行可能です。この制限により、従来の分析では高パラメーターのデータセットを操作できなくなりました。これらのデータセットの解析は、組織像から単一細胞をセグメント化し、次いで細胞型を同定するためのフローサイトメトリー様ゲーティング戦略を実施することによって達成された^16,17。しかし、これらの解析に影響を与える別の問題は、これらの手法では物理的に接触している細胞を正確に分離できる方法を採用していないため、対象のすべての細胞が物理的に分離されているデータセットでのみ機能することです。そのため、細胞が物理的に接触している場合でも、組織切片のシングルセル解析を行うことができる新しい方法が求められています。

この記事では、以前に紹介された¹⁸ 、広く利用可能な顕微鏡を使用して同時にイメージングできる蛍光パラメータの数を増やす、ヒストフローサイトメトリーと呼ばれる簡単なプロトコルについて説明します。このプロトコールは、スペクトル的に重なり合う色素で組織を染色し、スペクトル補償を使用して重なり合うチャネルからブリードスルーを除去し、明確な単一染色を得ることによって機能します。ハイパラメータ組織像の解析を容易にするために、フローサイトメトリーのようなゲーティング戦略を用いて細胞を異なる集団に選別する目的で、組織切片から単一細胞を抽出する詳細な解析パイプラインが記載されている。このプロトコルは、細胞がびまん性して存在する組織や、細胞が密接に圧縮されている組織で機能するため、この技術は、恒常性と神経炎症の両方におけるCNSのような組織の研究に汎用性があります。したがって、Histoflow Cytometryは、空間情報を維持しながら細胞を定義するために複数の細胞マーカーを必要とする複雑な細胞タイプ間の相互作用を研究するための有用な技術です。