Generación y análisis de imágenes histológicas de alto parámetro con citometría de histoflujo

La inflamación impulsada por las células del sistema inmunitario y las células gliales puede contribuir a trastornos crónicos del SNC en los que cada población puede promover la actividad de la otra ^1,2,3. La comprensión de cómo el sistema inmunitario interactúa con estos elementos del SNC para promover la inflamación del SNC es actualmente un tema de interés importante y se ha visto facilitado en gran medida por técnicas de alto parámetro, como la secuenciación de ARN unicelular. A través de la secuenciación de ARN unicelular, hemos descubierto que existe una amplia comunicación entre las células gliales y el sistema inmunitario en varios trastornos del SNC ^4,5,6. Comprender cómo estas interacciones están afectando a estos trastornos será crucial para dilucidar la biología de estas enfermedades.

Un problema con los análisis de secuenciación de una sola célula es que estas técnicas requieren que el tejido se interrumpa para obtener células individuales o núcleos, lo que resulta en una pérdida completa de información espacial. Saber dónde existe una célula en un tejido es fundamental para comprender el papel de la célula en la conducción de la inflamación. Por ejemplo, las células inmunitarias como las células B pueden concentrarse en el SNC durante la neuroinflamación; sin embargo, rara vez entran en el parénquima del SNC y en su lugar se concentran en las barreras del SNC⁷. Dada su localización, es poco probable que estas células contribuyan a la inflamación del SNC al interactuar físicamente con las células gliales en el parénquima del SNC, lo que sugiere que cualquier interacción que puedan tener con las células gliales ocurriría a través de factores secretados. Además, la patología que ocurre en los trastornos del SNC a menudo tiene una estructura ^8,9 tal que la localización de una célula en el tejido podría determinar críticamente si está contribuyendo activamente al trastorno o es un espectador. Por lo tanto, el uso de la orientación espacial para evaluar el papel de una célula en la patología es esencial.

Por lo general, el estudio de las células en los tejidos se ha llevado a cabo mediante el uso de inmunohistoquímica o microscopía de fluorescencia inmunitaria. Un problema con estas técnicas es que, por lo general, solo pueden obtener imágenes de hasta cuatro parámetros simultáneamente. Esta es una limitación importante de estas técnicas, ya que sabemos por citometría de flujo y análisis de secuenciación de ARN unicelular que muchas poblaciones celulares requieren dos o más parámetros para su identificación; Además, el número de parámetros necesarios suele aumentar cuando se buscan subconjuntos específicos de un tipo de célula¹⁰. Por lo tanto, no es práctico utilizar técnicas de imagen estándar para estudiar cómo pueden estar interactuando subconjuntos de células dentro de un tejido.

Este problema se ha superado parcialmente a través de nuevos métodos de alto parámetro que pueden retener información espacial, como la secuenciación espacial de ARN¹¹ y la citometría de masas^{de imágenes 12}. Si bien estas técnicas son valiosas, tienen varios problemas, como no estar ampliamente disponibles, reducir los datos tridimensionales a dos dimensiones y requerir una experiencia considerable para su ejecución. Otra técnica conocida como tinción secuencial, en la que los tejidos se tiñen con un conjunto de anticuerpos seguido de la inactivación del conjunto anterior de anticuerpos antes de teñirse con otro conjunto de anticuerpos, puede lograr una histología de alto parámetro sin necesidad de equipo especializado o experiencia 13,14,15 . Sin embargo, la tinción secuencial puede ser extremadamente laboriosa y requiere una gran cantidad de tiempo de microscopía, lo que puede ser poco práctico para los laboratorios que no poseen un microscopio personal. Por lo tanto, existe la necesidad de técnicas que puedan ampliar el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes a la vez en microscopios que estén ampliamente disponibles y de manera oportuna.

Una vez que se han adquirido los datos de alto parámetro, surge otro problema: es poco probable que los métodos convencionales de análisis de imágenes analicen con éxito los datos. Técnicas como el conteo manual o el umbral solo son viables si el análisis consta de un solo parámetro o si varios marcadores tienen la misma localización donde solo se cuentan las señales superpuestas. Esta limitación hace que el análisis tradicional sea inadecuado para trabajar con conjuntos de datos de parámetros altos. El análisis exitoso de estos conjuntos de datos se ha logrado mediante la segmentación de células individuales a partir de imágenes histológicas y luego la realización de estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo para identificar los tipos de células^16,17. Sin embargo, otro problema que afecta a estos análisis es que solo funcionan para conjuntos de datos en los que todas las celdas de interés están físicamente separadas entre sí, ya que estas técnicas no emplean métodos que puedan separar con precisión las celdas que están en contacto físico. Por lo tanto, se requiere un método más nuevo que pueda realizar análisis de células individuales en secciones de histología, incluso si las células están en contacto físico.

En este artículo, se describe un protocolo simple llamado citometría de histoflujo que ha sido introducido previamente¹⁸ y que amplía el número de parámetros fluorescentes que se pueden obtener imágenes simultáneamente utilizando microscopios ampliamente disponibles. Este protocolo funciona mediante la tinción de tejidos con tintes superpuestos espectralmente y luego el uso de la compensación espectral para eliminar el sangrado de los canales superpuestos para obtener tinciones individuales claras. Para facilitar el análisis de imágenes histológicas de alto parámetro, se describe una línea de análisis detallada que extrae células individuales de secciones de tejido con el fin de clasificar las células en poblaciones distintas utilizando estrategias de compuerta similares a la citometría de flujo. Este protocolo funciona en tejidos donde las células están presentes de manera difusa y en tejidos donde las células están muy compactadas entre sí, lo que hace que esta técnica sea versátil para el estudio de tejidos como el SNC tanto en la homeostasis como en la neuroinflamación. La citometría de histoflujo es, por lo tanto, una técnica útil para estudiar las interacciones entre tipos celulares complejos que requieren múltiples marcadores celulares para definir las células mientras se mantiene la información espacial.