Summary

Evaluación de la recuperación funcional de la actividad del diafragma eupneico después de la hemisección unilateral de la médula espinal cervical en ratas

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Las complicaciones respiratorias son la principal causa de muerte en individuos con lesión de la médula espinal cervical (SCI). Los modelos animales de cLME son esenciales para las evaluaciones mecánicas y los estudios preclínicos. Aquí, presentamos un método reproducible para evaluar la recuperación funcional de la actividad del músculo diafragma (DIAm) después de la hemisección espinal unilateral C2 (C2SH) en ratas.

Abstract

Después de la lesión de la médula espinal, la activación del DIAm puede verse afectada dependiendo de la extensión de la lesión. El presente manuscrito describe un modelo de hemisecciónC2 unilateral (C2SH) de SCI que interrumpe la actividad electromiográfica (EMG) del diafragma ipsilateral eupneico (iDIAm) durante la respiración en ratas. Para evaluar la recuperación del control motor DIAm, primero se debe establecer claramente el grado de déficit debido a C2SH. Al verificar una pérdida inicial completa de iDIAm EMG durante la respiración, la recuperación posterior se puede clasificar como ausente o presente, y el grado de recuperación se puede estimar utilizando la amplitud de EMG. Además, al medir la ausencia continuada de actividad EMG de iDIAm durante la respiración después del período de shock espinal agudo después deC2SH, se puede validar el éxito de la C2SH inicial. La medición de la actividad EMG del diafragma contralateral (cDIAm) puede proporcionar información sobre los efectos compensatorios de C2SH, que también refleja la neuroplasticidad. Además, los registros de DIAm EMG de animales despiertos pueden proporcionar información fisiológica vital sobre el control motor del DIAm después de C2SH. Este artículo describe un método para un modelo deC2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Introduction

Hay más de 300,000 personas con lesión de la médula espinal (SCI) en los Estados Unidos, aproximadamente la mitad de las cualestienen lesiones cervicales. Estas lesiones resultan en una pérdida significativa de bienestar y ejercen una presión financiera sobre las personas, sus familias y el sistema de atención médica. Afortunadamente, la mayoría de las lesiones de la médula espinal sonincompletas, lo que ofrece la posibilidad de fortalecer las vías preservadas. Esta neuroplasticidad puede permitir la recuperación de al menos algunas funciones, incluida la actividad DIAm, que es importante para los comportamientos ventilatorios y no ventilatorios. Por lo tanto, la promoción de la neuroplasticidad es una vía prometedora de investigación para ayudar a las personas con LME2.

Los modelos de LME en roedores tienen el potencial de contribuir sustancialmente al descubrimiento de tratamientos para mejorar la salud humana. Uno de los modelos clásicos de LM utilizados para estudiar la neuroplasticidad es la transección unilateral (hemisección) de la médula espinal enC2 (C2SH), que deja intacto el lado contralateral 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. El efecto deC2SH sobre la producción frénica y la importancia de las vías contralaterales preservadas fue revelado por primera vez hace más de cien años por Porter12, cuyo artículo seminal sentó las bases para los estudios modernos de la neuroplasticidad respiratoria. El modeloC2SH interrumpe las entradas descendentes del grupo respiratorio ventral rostral (rVRG) en la médula, que contiene las neuronas premotoras responsables de transmitir la salida de la generación del ritmo respiratorio14. Estas neuronas premotoras rVRG también transmiten el impulso neuronal excitatorio a las neuronas motoras frénicas (Figura 1). Varios investigadores han adoptado diferentes enfoques para el modelo C2SH 10,11,15,16, lo que puede explicar en parte parte la variabilidad en la recuperación entre los estudios. Brevemente, los abordajes varían en términos de preservar los funículos dorsales, realizar una hemisección completa o realizar una transección parcial lateral que no interrumpa completamente las entradas descendentes de la rVRG ipsilateral. En general, los modelos de C2SH son particularmente útiles para estudiar la neuroplasticidad respiratoria debido a las tasas de recuperación espontánea de la actividad electromiográfica (EMG) eupneica iDIAm a lo largo del tiempo, que puede mejorarse mediante varios factores, incluida la señalización neurotrófica 17,18,19,20,21. Sin embargo, primero se debe establecer una pérdida inicial de la función, definida como el silenciamiento de la actividad EMG eupneica de iDIAm, antes de que la recuperación pueda clasificarse claramente. Esta validación de la inactividad en el momento de la C2SH no se realiza en varios estudios 3,4,6,7,11,22,23.

Las evaluaciones histológicas de la médula espinal extirpada solo proporcionan evidencia de daño en la ubicación apropiada de las vías bulboespinales excitadoras ipsilaterales que inervan las neuronas motoras frénicas en la médula espinal, pero la histología no sustituye la evidencia fisiológica (p. ej., DIAm EMG). Además, las evaluaciones histológicas se realizan ex vivo en puntosterminales (a menudo varias semanas o meses después de la lesión) y no proporcionan información “en tiempo real”. Algunos investigadores han observado que la magnitud de la lesión se relaciona con la cantidad de déficit funcional o falta del mismo 5,24,25,26. Es importante tener en cuenta que la validez de tales afirmaciones probablemente depende en gran medida de cómo se clasifique la “función” (es decir, cuáles son las tareas funcionales y cómo se cuantifican), y la variabilidad entre los estudios pone de manifiesto la dificultad de producir lesiones funcionalmente idénticas en todos los animales. De hecho, los investigadores han enfatizado que la relación entre el grado de lesión y la función locomotora de los músculos de las extremidades (cuantificada por la puntuación de Basso, Beattie y Bresnahan (BBB)24) no es lineal27,28. En estudios previos, no hemos encontrado relación entre la extensión de la C2SH y el grado de recuperación de la actividad EMG eupneica iDIAm después de la lesión 10,29,30,31, aunque otros investigadores han reportado una relación entre la función ventilatoria y el grado de preservación de la sustancia blanca 5. Por lo tanto, en el caso del modelo C2SH, es beneficioso y necesario un enfoque para la validación funcional de la inactividad de iDIAm en el momento de la cirugía y, preferiblemente, en el curso temprano del curso del tiempo de los experimentos de lesión crónica de la médula espinal.

El presente artículo destaca el uso de DIAm EMG para la confirmación en tiempo real de la pérdida inicial de DIAm EMG durante la respiración después de la C2SH, así como las evaluaciones confirmatorias posteriores a los 3 días (Día 3) después de la lesión 18,21,31,32,33. En trabajos anteriores con el modelo C2SH, se realizaron laparotomías repetidas para registrar DIAm EMG 10,13,30,34. Sin embargo, trabajos más recientes han utilizado electrodos de EMG crónicos, que permiten el registro de EMG en ratas anestesiadas y despiertas. Además, los electrodos crónicos reducen el riesgo de neumotórax y no requieren laparotomías repetidas, lo que puede causar inhibición del DIAm35,36. A pesar de que las versiones del modelo C2SH han sido utilizadas por muchos investigadores, la confirmación del silenciamiento de la actividad de iDIAm no se realizó en el momento de la cirugía 3,4,6,7,11,22,23. Sin tal confirmación de la inactividad, es difícil saber qué parte de la recuperación posterior atribuir a la neuroplasticidad de las vías ipsilaterales frente a las contralaterales, que pueden tener impactos diferenciales. Esta es una consideración importante porque el impulso neuronal inspiratorio de la rVRG a las motoneuronas frénicas es principalmente ipsilateral, con una pérdida de aproximadamente el 50% de las entradas glutamatérgicas excitatorias a las neuronas motoras frénicas después de C2SH33. Sin embargo, quedan entradas excitadoras inspiratorias de la rVRG contralateral que decusan por debajo del sitio de la lesión para inervar las neuronas motoras frénicas ipsilaterales y pueden fortalecerse a través de la neuroplasticidad para promover la recuperación funcional. Al eliminar la entrada excitatoria ipsilateral predominante a las neuronas motoras frénicas, se pierde la actividad EMG eupneica iDIAm (al menos bajo anestesia), mientras que la actividad del cDIAm continúa e incluso se incrementa. La pérdida de la actividad EMG de iDIAm durante la respiración es, por lo tanto, una medida de un C2SH exitoso (Figura 2).

Algún nivel de actividad de iDIAm EMG está presente tan pronto como 1-4 días después de C2SH en animales despiertos23,37. Además, en animales descerebrados, la actividad de iDIAm está presente minutos u horas después de la hemisección cervical superior y es suprimida por la anestesia38. Además, el éxito del C2SH se valida al confirmar la ausencia de actividad de iDIAm EMG durante la respiración (eupnea) en ratas anestesiadas el día 3 después de la lesión. Los estudios de imagen confocal confirmaron la pérdida de entradas sinápticas glutamatérgicas en las neuronas motoras frénicas durante esta etapa inicial de la lesión37. En el día 3 después de la lesión, si hay alguna actividad eupneica residual de iDIAm EMG, esto se interpreta como evidencia de eliminación incompleta del impulso inspiratorio descendente ipsilateral de la rVRG. El presente artículo se divide en tres secciones: (1) registros crónicos de EMG DIAm, (2) C2SH y (3) adquisición de datos de EMG en animales despiertos y anestesiados. Este protocolo describe un modelo deC2SH riguroso, reproducible y fiable de cSCI en ratas, que es una excelente plataforma para estudiar la neuroplasticidad respiratoria, la actividad compensatoria de cDIAm y las estrategias terapéuticas y farmacéuticas.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mayo Clinic (Número de protocolo: A00003105-17-R23). Los animales del presente estudio fueron una mezcla de ratas Sprague-Dawley macho y hembra de aproximadamente 3 meses de edad y con un peso de entre 200 g y 350 g. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Implantación de electrodos Preparació…

Representative Results

El enfoque presentado en este artículo minimiza la variabilidad entre operadores mediante el establecimiento de criterios claros para evaluar DIAm EMG en un modelo de rata de C2SH. En primer lugar, se debe observar el cese de la actividad EMG eupneica de iDIAm inmediatamente después de C2SH, como se muestra en la Figura 2. De lo contrario, se puede realizar una transección secundaria hasta que desaparezca la actividad eupneica de iDIAm. En segundo lugar, en el día 3…

Discussion

Hemisección espinal C2
El procedimiento descrito en este artículo hace hincapié en las evaluaciones de la actividad de DIAm EMG que sirven como validación de una lesión espinal C2 que atraviesa los funículos lateral y ventral sin afectar los funículos dorsales (Figura 2A). El abordaje quirúrgico propuesto tiene dos beneficios principales. En primer lugar, preserva los funículos dorsales, que preservan la función ambulatoria en las ratas, al…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen la fuente de financiación de los NIH (NIH R01HL146114).

Materials

25 G Needle Cardinal Health 1188825100 Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided Ethicon J774D 3-0 Suture
Adson-Brown Forceps Fine Science Tools 11627-12 Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style Cage Braintree Scientific POR-530 Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP Shielded Biopac Systems, Inc LEAD110S Shielded lead wires for EMG
Data Acquisition Software LabChart LabChart 7.3.8 Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software – Matlab 2023b Mathworks, Inc. Version 23.2 General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting Knife Fine Science Tools 10056-12 Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11293-00 Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram Amplifier Biopac Systems, Inc EMG100C EMG amplifier
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply Module Biopac Systems, Inc IPS100C Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly Hemostats Fine Science Tools 13019-14 Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife Curette V. Mueller VM101-4414 Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting Scissors Biomedical Research Instruments, Inc. 11-2420 Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wire Cooner Wire, Inc. AS 631 AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35 ADInstruments PL3508 Data acquisition system
Scalpel Blade #11 Fine Science Tools 10011-00 Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley Rat Inotiv Order code: 002 Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical Microscope Olympus SZ61 Surgical microscope 
Suture Cutting Scissors George Tiemann & Co. 110-1250SB Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner Retractor Codman 50-5647 Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"

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Khurram, O. U., Fogarty, M. J., Zhan, W., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats. J. Vis. Exp. (208), e66828, doi:10.3791/66828 (2024).

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