Respiratoire complicaties zijn de belangrijkste doodsoorzaak bij personen met cervicale dwarslaesie (cSCI). Diermodellen van cSCI zijn essentieel voor mechanistische evaluaties en preklinische studies. Hier introduceren we een reproduceerbare methode om functioneel herstel van de activiteit van de middenrifspier (DIAm) te beoordelen na unilaterale C2 spinale hemisectie (C2SH) bij ratten.
Na cSCI kan de activering van de DIAm worden beïnvloed, afhankelijk van de omvang van het letsel. Het huidige manuscript beschrijft een unilateraal C2 hemisectie (C2SH) model van cSCI dat de eupneïsche ipsilaterale diafragma (iDIAm) elektromyografische (EMG) activiteit tijdens het ademen bij ratten verstoort. Om het herstel van de DIAm-motorische controle te evalueren, moet eerst de omvang van het tekort als gevolg van C2SH duidelijk worden vastgesteld. Door een volledig initieel verlies van iDIAm EMG tijdens de ademhaling te verifiëren, kan het daaropvolgende herstel worden geclassificeerd als afwezig of aanwezig, en kan de mate van herstel worden geschat met behulp van de EMG-amplitude. Bovendien kan het succes van de initiële C2SH worden gevalideerd door de aanhoudende afwezigheid van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling na de acute spinale shockperiode na C2SH te meten. Het meten van contralateraal diafragma (cDIAm) EMG-activiteit kan informatie opleveren over de compenserende effecten van C2SH, die ook neuroplasticiteit weerspiegelt. Bovendien kunnen DIAm EMG-opnames van wakkere dieren essentiële fysiologische informatie verschaffen over de motorische controle van de DIAm na C2SH. Dit artikel beschrijft een methode voor een rigoureus, reproduceerbaar en betrouwbaar C2SH-model van cSCI bij ratten, dat een uitstekend platform is voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit, compenserende cDIAm-activiteit en therapeutische strategieën en geneesmiddelen.
Er zijn meer dan 300.000 mensen met een dwarslaesie (SCI) in de Verenigde Staten, van wie ongeveer de helft cervicaal letselheeft. Deze verwondingen leiden tot een aanzienlijk verlies van welzijn en leggen een financiële druk op individuen, hun families en het gezondheidszorgsysteem. Gelukkig zijn de meeste SCI’s onvolledig, wat het potentieel biedt voor versterking van gespaard gebleven paden1. Deze neuroplasticiteit kan herstel van ten minste een deel van de functie mogelijk maken, waaronder DIA-activiteit, wat belangrijk is voor beademings- en niet-beademingsgedrag. Het bevorderen van neuroplasticiteit is dus een veelbelovende onderzoeksrichting om mensen met SCI2 te helpen.
Knaagdiermodellen van dwarslaesie hebben het potentieel om substantieel bij te dragen aan de ontdekking van behandelingen om de menselijke gezondheid te verbeteren. Een van de klassieke modellen van dwarslaesie die worden gebruikt om neuroplasticiteit te bestuderen, is een eenzijdige doorsnede (hemisectie) van het ruggenmerg bij C2 (C2SH), waarbij de contralaterale zijde intact blijft 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Het effect van C2SH op de phrenische output en het belang van gespaard gebleven contralaterale routes werd meer dan honderd jaar geleden voor het eerst onthuld door Porter12, wiens baanbrekende artikel de basis legde voor moderne studies van respiratoire neuroplasticiteit. Het C2SH-model onderbreekt de dalende input van de rostrale ventrale respiratoire groep (rVRG) in de medulla, die premotorische neuronen bevat die verantwoordelijk zijn voor het overbrengen van de output van respiratoire ritmegeneratie14. Deze rVRG premotorische neuronen zenden ook exciterende neurale drive uit naar frene motorneuronen (Figuur 1). Verschillende onderzoekers hebben verschillende benaderingen gekozen voor het C2SH-model 10,11,15,16, wat gedeeltelijk een deel van de variabiliteit in herstel in verschillende onderzoeken kan verklaren. Kortom, benaderingen variëren in termen van het sparen van de dorsale funiculi, het uitvoeren van een volledige hemisectie of het uitvoeren van een laterale gedeeltelijke transsectie die de dalende input van de ipsilaterale rVRG niet volledig onderbreekt. Over het algemeen zijn C2SH-modellen bijzonder nuttig voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit vanwege de snelheid van spontaan herstel van eupneutische iDIAm elektromyografische (EMG) activiteit in de loop van de tijd, die kan worden verbeterd door verschillende factoren, waaronder neurotrofe signalering 17,18,19,20,21. Een initieel functieverlies – gedefinieerd als het uitschakelen van eupneïsche iDIAm EMG-activiteit – moet echter eerst worden vastgesteld voordat herstel duidelijk kan worden geclassificeerd. Deze validatie van inactiviteit op het moment van C2SH is in verschillende onderzoeken niet gedaan 3,4,6,7,11,22,23.
Histologische beoordelingen van het uitgesneden ruggenmerg leveren alleen bewijs van schade aan de juiste locatie van ipsilaterale excitatoire bulbospinale routes die frene motorneuronen in het ruggenmerg innerven, maar histologie vervangt geen fysiologisch bewijs (bijv. DIAm EMG). Bovendien worden histologische beoordelingen in ex vivo uitgevoerd op terminale tijdstippen (vaak enkele weken tot maanden na het letsel) enleveren ze geen “real-time” informatie op. Sommige onderzoekers hebben opgemerkt dat de grootte van de laesie verband houdt met de hoeveelheid functioneel tekort of het ontbreken daarvan 5,24,25,26. Het is belangrijk op te merken dat de geldigheid van dergelijke beweringen waarschijnlijk sterk afhankelijk is van hoe “functie” wordt geclassificeerd (d.w.z. wat de functionele taken zijn en hoe ze worden gekwantificeerd), en de variabiliteit tussen studies benadrukt de moeilijkheid om functioneel identieke laesies bij dieren te produceren. Onderzoekers hebben inderdaad benadrukt dat de relatie tussen de mate van letsel en de locomotorische functie van de ledemaatspieren (gekwantificeerd door de Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) score24) niet lineair27,28 is. In eerdere studies hebben we geen verband gevonden tussen de mate van de C2SH en de mate van herstel van eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit na letsel 10,29,30,31, hoewel andere onderzoekers een verband hebben gerapporteerd tussen de beademingsfunctie en de mate van witte stof die 5 spaart. In het geval van het C2SH-model is een benadering voor functionele validatie van iDIAm-inactiviteit op het moment van de operatie en bij voorkeur vroeg in het tijdsverloop van experimenten met chronische ruggenmergletsel dus zowel nuttig als noodzakelijk.
Het huidige artikel onderstreept het gebruik van DIAm EMG voor real-time bevestiging van het initiële verlies van DIAm EMG tijdens de ademhaling na de C2SH, evenals daaropvolgende bevestigende beoordelingen 3 dagen (dag 3) na het letsel 18,21,31,32,33. In eerder werk met het C2SH-model werden herhaalde laparotomieën uitgevoerd om DIAm EMG 10,13,30,34 vast te leggen. Recenter werk heeft echter chronische EMG-elektroden gebruikt, waarmee EMG kan worden opgenomen bij verdoofde en wakkere ratten. Bovendien verminderen chronische elektroden het risico op pneumothorax en vereisen ze geen herhaalde laparotomieën, wat remming van de DIAm kan veroorzaken35,36. Hoewel versies van het C2SH-model door veel onderzoekers zijn gebruikt, was er op het moment vande operatie geen bevestiging van het uitschakelen van iDIAm-activiteit 3,4,6,7,11,22,23. Zonder een dergelijke bevestiging van inactiviteit is het moeilijk om te weten welk deel van het daaropvolgende herstel moet worden toegeschreven aan de neuroplasticiteit van ipsilaterale versus contralaterale routes, die differentiële effecten kunnen hebben. Dit is een belangrijke overweging omdat de inspiratoire neurale aandrijving van de rVRG naar phrenische motorneuronen voornamelijk ipsilateraal is, met een verlies van ongeveer 50% van de excitatoire glutamaterge input naar phrenische motorneuronen na C2SH33. Er zijn echter resterende inspiratoire prikkelende inputs van de contralaterale rVRG die onder de plaats van de laesie decusseren om ipsilaterale frenische motorneuronen te innerveren en kunnen worden versterkt via neuroplasticiteit om functioneel herstel te bevorderen. Door de overheersende ipsilaterale prikkelende input naar frene motorneuronen te verwijderen, gaat eupneïsche iDIAm EMG-activiteit verloren (althans onder anesthesie), terwijl de activiteit van de cDIAm doorgaat en zelfs wordt versterkt. Het verlies van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling is dus een maat voor een succesvolle C2SH (Figuur 2).
Een bepaald niveau van iDIAm EMG-activiteit is al 1-4 dagen na C2SH aanwezig bij wakkere dieren23,37. Bovendien is bij gedecrebraatte dieren de iDIAm-activiteit aanwezig binnen enkele minuten tot uren na de bovenste cervicale hemisectie en wordt deze onderdrukt door anesthesie38. Bovendien wordt het succes van de C2SH gevalideerd door de afwezigheid van iDIAm EMG-activiteit tijdens de ademhaling (eupneu) bij verdoofde ratten op dag 3 na het letsel te bevestigen. Confocale beeldvormingsstudies bevestigden het verlies van glutamaterge synaptische inputs op phrenic-motorneuronen tijdens dit beginstadium van het letsel37. Als er op dag 3 na het letsel enige resterende eupneuïsche iDIAm EMG-activiteit is, wordt dit geïnterpreteerd als bewijs van onvolledige verwijdering van ipsilaterale dalende inspiratoire drive van de rVRG. Het huidige artikel is verdeeld in drie secties: (1) chronische DIAm EMG-opnames, (2) C2SH en (3) EMG-data-acquisitie bij wakkere en verdoofde dieren. Dit protocol beschrijft een rigoureus, reproduceerbaar en betrouwbaar C2SH-model van cSCI bij ratten, dat een uitstekend platform is voor het bestuderen van respiratoire neuroplasticiteit, compenserende cDIAm-activiteit en therapeutische strategieën en geneesmiddelen.
C2 spinale hemisectie
De procedure die in dit artikel wordt beschreven, legt de nadruk op beoordelingen van DIAm EMG-activiteit die dienen als validatie van eenC2-spinale laesie die de laterale en ventrale funiculi doorsnijdt terwijl de dorsale funiculi worden gespaard (Figuur 2A). De voorgestelde chirurgische aanpak heeft twee grote voordelen. Ten eerste spaart het de dorsale funiculi, die de ambulante functie bij ratten behoudt, terwijl de ipsilate…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de NIH-financieringsbron (NIH-R01HL146114).
25 G Needle | Cardinal Health | 1188825100 | Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A |
3-0 Vicryl Violet Braided | Ethicon | J774D | 3-0 Suture |
Adson-Brown Forceps | Fine Science Tools | 11627-12 | Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm |
Bowman Style Cage | Braintree Scientific | POR-530 | Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic. |
Castroviejo Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated: Yes, Feature: Tungsten Carbide |
Clip Lead 1m TP Shielded | Biopac Systems, Inc | LEAD110S | Shielded lead wires for EMG |
Data Acquisition Software | LabChart | LabChart 7.3.8 | Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments |
Data Analysis Software – Matlab 2023b | Mathworks, Inc. | Version 23.2 | General purpose programming language for post hoc analysis |
Dissecting Knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30° |
Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar |
Electromyogram Amplifier | Biopac Systems, Inc | EMG100C | EMG amplifier |
Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved |
Isolated Power Supply Module | Biopac Systems, Inc | IPS100C | Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System |
Kelly Hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved |
Knife Curette | V. Mueller | VM101-4414 | Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm |
Micro Dissecting Scissors | Biomedical Research Instruments, Inc. | 11-2420 | Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm |
Multistranded stainless steel wire | Cooner Wire, Inc. | AS 631 | AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation). |
PowerLab 8/35 | ADInstruments | PL3508 | Data acquisition system |
Scalpel Blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel |
Scalpel Handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm |
Sprague Dawley Rat | Inotiv | Order code: 002 | Sprague Dawley outbred rats (female and male) |
Surgical Microscope | Olympus | SZ61 | Surgical microscope |
Suture Cutting Scissors | George Tiemann & Co. | 110-1250SB | Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5" |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight |
Weitlaner Retractor | Codman | 50-5647 | Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5" |
.