ラットの片側頸髄半切開後のユープネック横隔膜活動の機能回復の評価

米国には脊髄損傷(SCI)の個人が300,000万人以上おり、その約半数が頸部損傷^{を負っています1}。これらの怪我は、健康の大幅な損失をもたらし、個人、その家族、および医療システムに財政的な負担をかけます。幸いなことに、SCIの大部分は不完全であり、予備の経路¹を強化する可能性を提供しています。この神経可塑性により、換気および非換気行動に重要なDIAm活性を含む、少なくとも一部の機能の回復が可能になる可能性がある。したがって、神経可塑性の促進は、SCI² の個人を支援するための有望な研究手段です。

SCIのげっ歯類モデルは、人間の健康を改善するための治療法の発見に大きく貢献する可能性を秘めています。神経可塑性の研究に使用されるSCIの古典的なモデルの1つは、C₂(C₂SH)での脊髄の片側切断(半切断)であり、これにより反対側は無傷のままになります^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13}。横隔膜分泌物に対するC₂SHの影響と、温存された対側経路の重要性は、100年以上前にポーター12によって初めて明らかにされました。^{ポーター12}は、呼吸器神経可塑性に関する現代の研究の基礎を築いた独創的な論文を発表しました。C₂SHモデルは、呼吸リズム生成¹⁴の出力を伝達する役割を担う運動前ニューロンを含む髄質内の吻側腹側呼吸群(rVRG)からの下降入力を中断する。これらのrVRG運動前ニューロンは、興奮性神経ドライブを横隔膜運動ニューロンにも伝達します(図1)。何人かの研究者がC₂SHモデル10,11,15,16に対して異なるアプローチを取っており、これが研究間の回復のばらつきの一部を部分的に説明している可能性がある。簡単に言えば、アプローチは、背側フニキュリを温存する、完全な半切開を実行する、または同側rVRGからの下降入力を完全に中断しない側方部分離断を実行するという点で異なります。一般に、C₂SHモデルは、ユープニーのiDIAm筋電図(EMG)活動の経時的な自然回復率による呼吸器神経可塑性の研究に特に有用であり、これは神経栄養シグナル伝達17,18,19,20,21を含むいくつかの要因によって改善できます.ただし、初期の機能喪失(ユープネックiDIAm EMG活動のサイレンシングとして定義される)は、回復を明確に分類する前に最初に確立する必要があります。C₂SHの時点での不活動のこの検証は、いくつかの研究3,4,6,7,11,22,23では行われていません。

切除された脊髄の組織学的評価は、脊髄の横隔運動ニューロンを神経支配する同側の興奮性球脊髄経路の適切な位置に対する損傷の証拠を提供するだけですが、組織学は生理学的証拠(例、DIAm EMG)に代わるものではありません。さらに、組織学的評価は、最終時点(多くの場合、損傷後数週間から数か月)でex vivoで実施されるため、「リアルタイム」な情報は提供されません。一部の研究者は、病変の大きさが機能障害またはその欠如の量に関連していると指摘しています5,24,25,26。このような主張の妥当性は、「機能」がどのように分類されるか(すなわち、機能的課題が何であるか、そしてそれらがどのように定量化されるか)に大きく依存する可能性が高く、研究間のばらつきは、動物間で機能的に同一の病変を生成することの難しさを浮き彫りにしていることに注意することが重要です。実際、研究者は、損傷の程度と四肢の筋肉運動機能との関係(Basso、Beattie、およびBresnahan(BBB)スコア²⁴によって定量化)は線形ではないと強調しています^27,28。以前の研究では、C₂SHの範囲と損傷後のユープネックiDIAm EMG活動の回復の程度との間に関係は見られませんでした10,29,30,31、他の研究者は、換気機能と白質温存の程度との関係を報告しています⁵。したがって、C₂SH モデルの場合、手術時、できれば慢性脊髄損傷実験の時間経過の早い段階で iDIAm の不活動性を機能的に検証するアプローチは、有益であり、必要でもあります。

本稿では、C₂SH後の呼吸中のDIAm EMGの初期損失をリアルタイムで確認するためのDIAm EMGの使用と、損傷の3日後(3日目)の確認評価18,21,31,32,33を強調しています。C₂SHモデルを使用した以前の研究では、DIAm EMG ^10,13,30,34を記録するために繰り返し開腹術が行われました。しかし、より最近の研究では、麻酔をかけられたラットと覚醒したラットのEMGの記録を可能にする慢性EMG電極が使用されています。さらに、慢性電極は気胸のリスクを軽減し、DIAm^35,36の阻害を引き起こす可能性のある開腹術を繰り返す必要がありません。C₂SHモデルのバージョンは多くの研究者によって使用されてきましたが、手術3,4,6,7,11,22,23の時点では、iDIAm活性のサイレンシングの確認は行われていませんでした。このような不活動性の確認がなければ、その後の回復のどの部分が同側経路と対側経路の神経可塑性に起因するかを知ることは困難です。rVRGから横隔神経ニューロンへの吸気神経駆動は主に同側性であり、C₂SH³³以降に横隔運動ニューロンへの興奮性グルタミン酸作動性入力の約50%が失われるため、これは重要な考慮事項です。ただし、反対側の rVRG からの吸気興奮性入力が残っており、病変部位の下を咀嚼して同側横隔膜運動ニューロンを神経支配し、神経可塑性を介して強化して機能回復を促進することができます。横隔膜運動ニューロンへの主要な同側興奮性入力を取り除くことにより、ユープネック iDIAm EMG 活性は (少なくとも麻酔下では) 失われますが、cDIAm の活性は継続し、さらに強化されます。したがって、呼吸中のiDIAm EMG活動の喪失は、成功したC₂SHの尺度です(図2)。

覚醒動物^23,37では、C₂SHの1〜4日後に、ある程度のiDIAm EMG活動が見られる。さらに、脱脳動物では、上部頸部半切除後数分から数時間以内にiDIAm活性が存在し、麻酔によって抑制される³⁸。さらに、C₂SHの成功は、損傷後3日目に麻酔をかけたラットの呼吸中(ユープネア)にiDIAm EMG活性がないことを確認することで検証されます。共焦点イメージング研究により、この損傷の初期段階で横隔膜運動ニューロン上のグルタミン酸作動性シナプス入力の喪失が確認された³⁷。損傷後 3 日目に、嘲眠 iDIAm EMG 活動が残っている場合、これは rVRG からの同側下行吸気ドライブの不完全な除去の証拠と解釈されます。本稿は、(1)慢性DIAm EMG記録、(2)C₂SH、(3)覚醒動物および麻酔動物におけるEMGデータ取得の3つのセクションに分かれています。このプロトコルは、ラットにおけるcSCIの厳密で再現性があり、信頼性の高いC₂SHモデルについて説明しており、呼吸器神経可塑性、代償性cDIAm活性、治療戦略および医薬品を研究するための優れたプラットフォームです。