Summary

Valutazione del recupero funzionale dell'attività del diaframma eupneico dopo emisezione unilaterale del midollo spinale cervicale nei ratti

Published: June 14, 2024
doi:

Summary

Le complicanze respiratorie sono la principale causa di morte nei soggetti con lesione del midollo spinale cervicale (cSCI). I modelli animali di cSCI sono essenziali per le valutazioni meccanicistiche e gli studi preclinici. Qui, introduciamo un metodo riproducibile per valutare il recupero funzionale dell’attività del muscolo diaframma (DIAm) dopo emisezione spinale C2 unilaterale (C2SH) nei ratti.

Abstract

Dopo la cSCI, l’attivazione del DIAm può essere influenzata a seconda dell’entità della lesione. Il presente manoscritto descrive un modello unilaterale di emisezione C2 (C2SH) di cSCI che interrompe l’attività elettromiografica (EMG) del diaframma omolaterale eupnico (iDIAm) durante la respirazione nei ratti. Per valutare il recupero del controllo motorio della DIAm, è necessario innanzitutto stabilire chiaramente l’entità del deficit dovuto al C2SH. Verificando una perdita iniziale completa di iDIAm EMG durante la respirazione, il recupero successivo può essere classificato come assente o presente e l’entità del recupero può essere stimata utilizzando l’ampiezza dell’EMG. Inoltre, misurando la continua assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione dopo il periodo di shock spinale acuto successivo a C2SH, il successo del C2SH iniziale può essere convalidato. La misurazione dell’attività EMG del diaframma controlaterale (cDIAm) può fornire informazioni sugli effetti compensatori del C2SH, che riflette anche la neuroplasticità. Inoltre, le registrazioni EMG DIAm di animali svegli possono fornire informazioni fisiologiche vitali sul controllo motorio del DIAm dopo C2SH. Questo articolo descrive un metodo per un modello C2SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un’eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell’attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Introduction

Ci sono più di 300.000 individui con lesione del midollo spinale (SCI) negli Stati Uniti, circa la metà dei quali ha lesioni cervicali1. Queste lesioni provocano una significativa perdita di benessere e mettono a dura prova gli individui, le loro famiglie e il sistema sanitario. Fortunatamente, la maggior parte delle lesioni del midollo spinale sono incomplete, fornendo il potenziale per il rafforzamento dei percorsi risparmiati1. Questa neuroplasticità può consentire il recupero di almeno alcune funzioni, inclusa l’attività DIAm, che è importante per i comportamenti ventilatori e non ventilatori. Pertanto, la promozione della neuroplasticità è una strada promettente di ricerca per aiutare le persone con lesionemidollare 2.

I modelli di roditori di lesione midollare hanno il potenziale per contribuire in modo sostanziale alla scoperta di trattamenti per migliorare la salute umana. Uno dei modelli classici di LM utilizzati per studiare la neuroplasticità è una transezione unilaterale (emisezione) del midollo spinale a C2 (C2SH), che lascia intatto il lato controlaterale 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. L’effetto del C2SH sulla produzione frenica e l’importanza di risparmiare le vie controlaterali sono state rivelate per la prima volta oltre cento anni fa da Porter12, il cui articolo seminale ha gettato le basi per gli studi moderni sulla neuroplasticità respiratoria. Il modello C2SH interrompe gli input discendenti dal gruppo respiratorio ventrale rostrale (rVRG) nel midollo, che contiene i neuroni premotori responsabili della trasmissione dell’output della generazione del ritmo respiratorio14. Questi neuroni premotori rVRG trasmettono anche l’impulso neurale eccitatorio ai motoneuroni frenici (Figura 1). Diversi ricercatori hanno adottato approcci diversi al modello C2SH 10,11,15,16, il che può in parte spiegare parte della variabilità nel recupero tra gli studi. In breve, gli approcci variano in termini di risparmio dei funicoli dorsali, esecuzione di un’emisezione completa o esecuzione di una transezione parziale laterale che non interrompa completamente gli input discendenti dall’rVRG omolaterale. In generale, i modelli C2SH sono particolarmente utili per lo studio della neuroplasticità respiratoria a causa dei tassi di recupero spontaneo dell’attività elettromiografica (EMG) dell’iDIAm eupneica nel tempo, che può essere migliorata da diversi fattori, tra cui la segnalazione neurotrofica 17,18,19,20,21. Tuttavia, una perdita iniziale di funzione, definita come il silenziamento dell’attività eupneica iDIAm EMG, deve essere stabilita prima che il recupero possa essere chiaramente classificato. Questa convalida dell’inattività al momento del C2SH non viene effettuata in diversi studi 3,4,6,7,11,22,23.

Le valutazioni istologiche del midollo spinale asportato forniscono solo l’evidenza di un danno alla posizione appropriata delle vie bulbospinali eccitatorie omolaterali che innervano i motoneuroni frenici nel midollo spinale, ma l’istologia non sostituisce l’evidenza fisiologica (ad esempio, DIAm EMG). Inoltre, le valutazioni istologiche vengono eseguite in ex vivo in momenti terminali (spesso da diverse settimane a mesi dopo l’infortunio) e non forniscono informazioni “in tempo reale”. Alcuni ricercatori hanno notato che l’entità della lesione è correlata alla quantità di deficit funzionale o alla sua mancanza 5,24,25,26. È importante notare che la validità di tali affermazioni dipende probabilmente fortemente da come viene classificata la “funzione” (cioè, quali sono i compiti funzionali e come vengono quantificati), e la variabilità tra gli studi evidenzia la difficoltà di produrre lesioni funzionalmente identiche tra gli animali. In effetti, i ricercatori hanno sottolineato che la relazione tra l’entità della lesione e la funzione locomotoria dei muscoli degli arti (quantificata dal punteggio di Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)24) non è lineare27,28. In studi precedenti, non abbiamo trovato alcuna relazione tra l’entità del C2SH e l’entità del recupero dell’attività EMG eupneica iDIAm post-lesione 10,29,30,31, sebbene altri ricercatori abbiano riportato una relazione tra la funzione ventilatoria e l’entità della sostanza bianca che risparmia 5. Pertanto, nel caso del modello C2SH, un approccio per la convalida funzionale dell’inattività di iDIAm al momento dell’intervento chirurgico e preferibilmente all’inizio del decorso temporale degli esperimenti di lesione cronica del midollo spinale è sia vantaggioso che necessario.

Il presente articolo sottolinea l’uso di DIAm EMG per la conferma in tempo reale della perdita iniziale di DIAm EMG durante la respirazione dopo il C2SH, nonché per successive valutazioni di conferma a 3 giorni (Giorno 3) dopo l’infortunio 18,21,31,32,33. In precedenti lavori con il modello C2SH, sono state eseguite laparotomie ripetute per registrare DIAm EMG 10,13,30,34. Tuttavia, lavori più recenti hanno utilizzato elettrodi EMG cronici, che consentono la registrazione dell’EMG in ratti anestetizzati e svegli. Inoltre, gli elettrodi cronici riducono il rischio di pneumotorace e non richiedono laparotomie ripetute, che possono causare l’inibizione del DIAm 35,36. Sebbene le versioni del modello C2SH siano state utilizzate da molti ricercatori, la conferma del silenziamento dell’attività di iDIAm non è stata fatta al momento dell’interventochirurgico 3,4,6,7,11,22,23. Senza una tale conferma di inattività, è difficile sapere quale parte del successivo recupero attribuire alla neuroplasticità delle vie omolaterali rispetto a quelle controlaterali, che possono avere impatti differenziali. Questa è una considerazione importante perché l’unità neurale inspiratoria dall’rVRG ai motoneuroni frenici è principalmente omolaterale, con una perdita di circa il 50% degli input glutammatergici eccitatori ai motoneuroni frenici dopo C2SH33. Tuttavia, ci sono rimanenti input eccitatori inspiratori dall’rVRG controlaterale che decussano al di sotto del sito della lesione per innervare i motoneuroni frenici omolaterali e possono essere rafforzati attraverso la neuroplasticità per promuovere il recupero funzionale. Rimuovendo l’input eccitatorio omolaterale predominante ai motoneuroni frenici, l’attività eupneica dell’iDIAm EMG viene persa (almeno sotto anestesia), mentre l’attività del cDIAm continua e viene persino migliorata. La perdita di attività dell’iDIAm EMG durante la respirazione è quindi una misura del successo di un C2SH (Figura 2).

Un certo livello di attività EMG iDIAm è presente già 1-4 giorni dopo C2SH negli animali svegli23,37. Inoltre, negli animali decerebrati, l’attività di iDIAm è presente da pochi minuti a ore dopo l’emisezione cervicale superiore ed è soppressa dall’anestesia38. Inoltre, il successo del C2SH è convalidato dalla conferma dell’assenza di attività EMG iDIAm durante la respirazione (eupnea) nei ratti anestetizzati il giorno 3 dopo l’infortunio. Studi di imaging confocale hanno confermato la perdita di input sinaptici glutammatergici sui motoneuroni frenici durante questa fase iniziale della lesione37. Al 3° giorno dopo l’infortunio, se c’è una qualsiasi attività EMG eupneica residua, questa viene interpretata come prova di rimozione incompleta dell’unità inspiratoria discendente omolaterale dall’rVRG. Il presente articolo è diviso in tre sezioni: (1) registrazioni croniche di DIAm EMG, (2) C2SH e (3) acquisizione di dati EMG in animali svegli e anestetizzati. Questo protocollo descrive un modello C2SH rigoroso, riproducibile e affidabile di cSCI nei ratti, che è un’eccellente piattaforma per lo studio della neuroplasticità respiratoria, dell’attività compensatoria del cDIAm e delle strategie terapeutiche e farmaceutiche.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Mayo Clinic (numero di protocollo: A00003105-17-R23). Gli animali nel presente studio erano un mix di ratti Sprague-Dawley maschi e femmine di circa 3 mesi di età e di peso compreso tra 200 g e 350 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali. 1. Impianto di elettrodi Preparazion…

Representative Results

L’approccio presentato in questo articolo riduce al minimo la variabilità interoperatore stabilendo criteri chiari per la valutazione dell’EMG DIAm in un modello di ratto di C2SH. In primo luogo, deve essere osservata la cessazione dell’attività EMG eupneica iDIAm immediatamente dopo C2SH, come mostrato nella Figura 2. In caso contrario, è possibile eseguire una transezione secondaria fino alla scomparsa dell’attività eupneica dell’iDIAm. In secondo luogo, il giorno…

Discussion

C2 emisezione spinale
La procedura descritta in questo articolo enfatizza le valutazioni dell’attività DIAm EMG che fungono da convalida di una lesione spinale C2 che seziona i funicoli laterali e ventrali risparmiando i funicoli dorsali (Figura 2A). L’approccio chirurgico proposto ha due vantaggi principali. In primo luogo, risparmia i funiculi dorsali, che preservano la funzione deambulatoria nei ratti, pur continuando a recidere gli input omolate…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la fonte di finanziamento NIH (NIH R01HL146114).

Materials

25 G Needle Cardinal Health 1188825100 Covidien Monoject Hypdermic Standard Needles: 25 G x 1" (0.508 mm x 2.5 cm) A
3-0 Vicryl Violet Braided Ethicon J774D 3-0 Suture
Adson-Brown Forceps Fine Science Tools 11627-12 Tip Shape: Straight, Tips: Shark Teeth, Tip Width: 1.4mm, Tip Dimensions: 2 x 1.4 m, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Bowman Style Cage Braintree Scientific POR-530 Weight range: 250 up to 750 g; Maximum length: 9" (228 mm); Basic unit is constructed of .5" (123 mm) jeweled acrylic.
Castroviejo Needle Holder Fine Science Tools 12565-14 Tip Shape: Straight, Tip Width: 1.5 mm, Clamping Length: 10 mm, Lock: Yes, Scissors: No, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14 cm, Serrated:
Yes, Feature: Tungsten Carbide
Clip Lead 1m TP Shielded Biopac Systems, Inc LEAD110S Shielded lead wires for EMG
Data Acquisition Software LabChart LabChart 7.3.8 Data recording, visualization, and analysis software for multi-channel recordings and real-time assessments
Data Analysis Software – Matlab 2023b Mathworks, Inc. Version 23.2 General purpose programming language for post hoc analysis
Dissecting Knife Fine Science Tools 10056-12 Cutting Edge: 4 mm, Thickness: 0.5 mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12.5 cm, Blade Shape: Angled 30°
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools 11293-00 Style: #3, Tip Shape: Straight, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 x 0.1 mm, Length: 12 cm, Alloy / Material: Dumostar
Electromyogram Amplifier Biopac Systems, Inc EMG100C EMG amplifier
Friedman Rongeur Fine Science Tools 16000-14 Tip Shape: Curved, Cup Size: 2.5mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 13cm, Joint Action: Single
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Joint Action: Single, Cup Size: 1mm, Tip Shape: Curved
Isolated Power Supply Module Biopac Systems, Inc IPS100C Operates 100-series amplifier modules indepdent of the Biopac Systems, Inc.'s MP series Data Acquisition System
Kelly Hemostats Fine Science Tools 13019-14 Tips: Serrated, Tip Width: 1.5mm, Clamping Length: 22mm, Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 14cm, Tip Shape: Curved
Knife Curette V. Mueller VM101-4414 Tip: Sharp, Tip Diameter: 2 mm
Micro Dissecting Scissors Biomedical Research Instruments, Inc. 11-2420 Length: 4", Angle: Straight, Blade Length: 23 mm
Multistranded stainless steel wire Cooner Wire, Inc. AS 631 AWG 40; Overall diameter: 0.011 mm (with insulation), 0.008 mm (without insulation).
PowerLab 8/35 ADInstruments PL3508 Data acquisition system
Scalpel Blade #11 Fine Science Tools 10011-00 Blade Shape: Angled, Cutting Edge: 20 mm, Thickness: 0.4 mm, Alloy / Material: Carbon Steel
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Alloy / Material: Stainless Steel, Length: 12 cm
Sprague Dawley Rat Inotiv Order code: 002 Sprague Dawley outbred rats (female and male)
Surgical Microscope Olympus SZ61 Surgical microscope 
Suture Cutting Scissors George Tiemann & Co. 110-1250SB Alloy / Material: Stainless Steel, Tip Shape: Straight, Tips: Sharp/Blunt, Length: 4.5"
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08 Tips: Sharp, Cutting Edge: 2.5 mm, Tip Diameter: 0.05 mm, Length: 8 cm, Alloy / Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight
Weitlaner Retractor Codman 50-5647 Prongs: 2 x 3 Blunt, Length: 4.5"

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Khurram, O. U., Fogarty, M. J., Zhan, W., Mantilla, C. B., Sieck, G. C. Assessing Functional Recovery of Eupneic Diaphragm Activity Following Unilateral Cervical Spinal Cord Hemisection in Rats. J. Vis. Exp. (208), e66828, doi:10.3791/66828 (2024).

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